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目的:癌症死亡的原因主要是癌症被诊断时已经处在中晚期,即使通过手术,放疗,化疗或免疫治疗后,肿瘤容易复发和转移。肝癌在中国的发病率和死亡率就特别高,病因非常复杂,常见由是于HBV/HCV感染,黄曲霉素,酒精,肝硬化等原因。目前临床上没有特别好的治疗手段,而且治疗后容易转移和复发。肿瘤的发生发展依赖于肿瘤的微环境,研究表明,缺氧微环境是肿瘤发生发展过程中最常见最重要的微环境之一,将肿瘤的代谢方式从三羧酸循环转变为糖酵解途径,通过HIF等重要的转录因子和其他重要基因激活相应的通路,从而促进肿瘤的增殖和转移。肝癌在发生发展过程中存在明显的缺氧现象,特别是通过动脉化疗栓塞手术治疗后,会出现非常明显的缺氧情况,将会导致肿瘤的复发和转移,临床治疗效果差。随着二代测序技术大规模的应用,大量的非编码RNA被发现,包括:miRNA、lncRNA、circularRNA、snRNA等,研究发现这些非编码RNA对肿瘤的发生发展有着重要的作用。研究表明长链非编码RNA HOTTIP在肝癌临床标本中高表达,与肝癌的转移正相关,与肝癌的预后负相关,在肝癌的发生发展中发挥重要的功能,但其促进肿瘤转移的具体机制尚不清楚。因此本研究主要集中在缺氧的微环境下,长链非编码RNA HOTTIP促进肝癌细胞转移的分子机制研究。方法:1.探究缺氧环境下,缺氧诱导因子HIF-1α与长链非编码RNA HOTTIP之间的相互调节作用。向诱导罐充入低氧混合气体(5%CO2,1%O2,94%N2),模拟肿瘤的缺氧微环境。敲低和过表达HIF-1α来研究HIF-1α对HOTTIP的调节作用;再采用荧光报告基因实验来研究HIF-1α是否作为转录因子通过转录调控HOTTIP的表达。反过来研究HOTTIP对HIF-1α调节作用及机制,研究两者是否形成正反馈调节。2.探究缺氧环境下,长链非编码RNA HOTTIP对肝癌细胞发生上皮间质转化的影响以及哪个分子介导此过程。缺氧诱导模型来研究肝癌细胞在缺氧微环境中,细胞形态的变化和EMT相关标志物表达量的变化。肝癌细胞在正常培养和缺氧诱导下,敲低和过表达HOTTIP,研究HOTTIP对EMT相关标志物mRNA和蛋白表达量的影响。同样采用以上实验,来研究哪个emt诱导因子介导了长链非编码rnahottip对emt标志物的调节作用。3.探究长链非编码rnahottip对emt诱导因子调节的具体分子机制。生物信息学筛选出靶向的mirna。缺氧条件下,分别敲低和过表达hottip来研究mirna,emt诱导因子和emt标志物之间的相关关系。在稳定敲低hottip的细胞中,转染进mirnainhibitor,研究对emt诱导因子表达量的影响;最后采用双荧光报告基因的实验,研究hottip和mirna的竞争强弱对插入到荧光报告载体中的emt诱导因子的表达影响。敲低以及过表达hottip后,检测wdr5蛋白的表达量变化;敲低或过表达wdr5后,检测zeb1的mrna和蛋白表达变化;在稳定敲低hottip组,再过表达wdr5,和对照组比较,检测zeb1蛋白水平能否被恢复。结果:1.肝癌细胞缺氧培养后,长链非编码rnahottip的表达量明显升高。用dfo过表达或sirna敲低hif-1α后,检测到hottip的表达量升高或下降。hottip的启动子区包含hre的片段插入到pgl3荧光报告基因载体中,敲低或过表达hif-1α后,荧光活性明显减弱或增强,表明hif-1α作为转录因子调节hottip的表达。正常培养和缺氧诱导下,敲低或过表达hottip,hif-1α蛋白表达量明显下降或上升;敲低hif-1α后,再过表达hottip,检测到hif-1α的蛋白水平能被恢复。在稳定敲低hottip的细胞中,用chx阻断蛋白质翻译,hif-1α在敲低组蛋白降解的速率明显增强;再用mg132来阻断hif-1α降解的泛素蛋白酶体途径,在敲低组hif-1α蛋白表达量也逐渐累积。2.缺氧诱导48h后,肝癌细胞形态变成明显的长梭型,利于细胞的迁移。emt标志物n-cadherin、vimentin或e-cadherin的mrna水平和蛋白表达水平都明显升高或下调。正常培养条件下,敲低和过表达hottip,emt标志物n-cadherin、e-cadherin和vimentin,emt诱导因子snail1、snail2、zeb1、zeb2都没有变化,然而在缺氧诱导的条件下,敲低或过表达hottip后,只有zeb1和e-cadherin的mrna和蛋白表达水平都明显变化。3.预测发现mirna-200a可能是潜在的靶基因,在缺氧条件下,敲低或过表hottip,mirna-200a表达上升或下降,zeb1表达下降或升高,e-cadherin表达升高或下降。在稳定敲低hottip的细胞中,与对照组相比,zeb1的表达下降,e-cadherin的表达明显上升,但转染进了mirna-200a的inhibitor后,zeb1的表达明显恢复,最终E-cadherin的表达下降;HOTTIP与miRNA-200a结合的区域插到双荧光报告基因载体psiCHECK-2,随着miRNA-200a浓度的增加,荧光活性越来越弱;正常条件和缺氧诱导下,敲低或过表达HOTTIP发现WDR5蛋白表达量明显下降或上升,肝癌细胞中敲低或过表达WDR5后,检测到ZEB1的mRNA水平没有变化,蛋白水平明显下降或上升。在稳定敲低HOTTIP组,WDR5蛋白表达水平下降,ZEB1蛋白水平下降,再过表达WDR5后,ZEB1蛋白水平被明显恢复。结论:长链非编码RNA HOTTIP介导了肝癌细胞在缺氧微环境中发生上皮间质转化(EMT)的过程,通过转录因子HIF-1α转录激活HOTTIP的高表达,HOTTIP作为ceRNA吸附miRNA-200a,从而促进ZEB1的表达以及HOTTIP能稳定WDR5蛋白,同时促进ZEB1蛋白的高表达,进而抑制E-cadherin的表达,最终使肝癌细胞发生转移。