论文部分内容阅读
海栖热袍菌Thermotogamaritima是嗜极端高温的厌氧细菌，其产生的葡萄糖异构酶由于其出色的耐热性有着潜在的工业应用价值。由于T.maritima苛刻的培养条件导致其葡萄糖异构酶产量较低。通过PCR方法克隆T.maritimaMSB8编码葡萄糖异构酶基因xylA至大肠杆菌Escherichiacoli热激表达质粒pHsh，构建重组质粒pHsh-xylAl。通过mRNA二级结构在线分析软件MFOLD对重组质粒pHsh-xylAl中翻译起始位点AUG附近mRNA二级结构的空间构象与mRNA二级结构自由能进行分析，在不改变目的基因翻译的氨基酸序列的前提下，利用同义突变和改变AUG前某些碱基序列的方法，达到打破mRNA的核糖体结合位点及翻译起始位点的茎环结构，提高mRNA自由能的目的，构建优化后表达质粒pHsh-xylA2。电击转化E.coliJM109，诱导表达，分析酶活，E.coliJM109(pHsh-xylA2)酶活为3.6U/mL发酵液，比酶活为4.95U/mg粗蛋白，是优化前的3.8倍。
通过热处理和离子交换层析纯化两步得到电泳纯的酶制品，纯化倍数和回收率分别为8.02和49.02。对酶学性质研究表明，该重组酶为金属离子激活性酶，Mg2+，Co2+对相对酶活有很强的激活作用，其最适pH为7.0，最适反应温度为95℃，且在pH6～8之间有着较好的稳定性，在95℃下半衰期长达5h以上。以葡萄糖为底物时的表观Km和Vmax分别为105mmol/L和45.2U/mg。
通过在摇瓶条件的优化，得到经济适用、适合重组菌E.coliJM109(pHsh-xylA2)发酵的合成培养基配方：葡萄糖10g/L，(NH4)2SO46g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO410g/L,MgSo4·7H2o3g/L，柠檬酸3g/L，TES1mL/L，pH7.0。在3.7L台式发酵罐中，在控制溶氧30％以上，在重组菌的对数生长中期开始流加碳氮源，在对数生长后期升温诱导8h，最终菌体光密度达到44.8，重组菌发酵液酶活为15.6U/mL，比酶活为4.23U/mg粗蛋白。