叶酸作为一类人体必需的B族维生素,在人体代谢循环中起到十分重要的作用。然而,叶酸对光、氧气、高温和低pH等环境因素敏感,极易发生降解而失活。叶酸的稳定性可通过添加小分子抗氧化剂、与蛋白质复合或利用包埋技术得到改善。目前抗氧化剂保护叶酸的构效关系及机制仍在探索阶段。同时,抗氧化剂作为另一种活性成分,却很少有研究关注抗氧化剂在起到保护作用的同时其自身发生的结构和活性的变化。蛋白质作为一类重要的生物大分子,具有配体结合、自组装和多糖复合等性质,可对活性成分进行有效包埋和保护。在环境敏感的条件下,活性成分的氧化降解会引起蛋白质载体的组成、结构和生物活性的改变,但机理尚不明确。本论文在研究活性成分间相互作用的基础上,制备水溶性蛋白质的分子复合物和醇溶性蛋白质的核壳空心/实心结构纳米粒子载体体系,研究体系中活性成分间及与蛋白质的相互作用,阐明蛋白质和活性成分的稳定和失稳机制,为选择和设计合适的蛋白质载体提供基础数据。首先,以长波紫外光(UVA)辐照作为环境因素诱导叶酸降解,选取具有不同分子结构的小分子抗氧化剂与叶酸共混,采用荧光光谱仪和高效液相色谱仪(HPLC)研究对叶酸光稳定性提高的构效关系。同时采用DPPH和ABTS法研究其在降解过程中的抗氧化性,揭示降解对生物活性的影响,在此基础上深入讨论保护机制。研究得出添加抗氧化剂可提高叶酸的光稳定性,且酚类物质的保护效果和抗氧化能力比含烯烃双键化合物强,各抗氧化剂保护叶酸顺序为:咖啡酸>邻苯二酚>槲皮素>阿魏酸≈对香豆酸>表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)>白藜芦醇>姜黄素>对苯醌>愈创木酚>曲酸>5-羟基对萘醌>水杨酸>β-紫罗兰酮>视黄醇>亚油酸≈反式二苯乙烯≈2-苯基色原酮>油酸≈肉桂酸≈乙酰水杨酸。光照后咖啡酸、对苯醌、乙酰水杨酸和β-紫罗兰酮的ABTS·~+清除能力显著提高,而阿魏酸、曲酸和水杨酸的ABTS·~+清除能力有所降低,其他抗氧化剂保持不变。在保护叶酸方面各抗氧化剂光降解后的抗氧化性比抗氧化剂本身起到了更决定性的作用。另外,抗氧化剂在光照后对UVA波段的吸收能力也是光保护作用的重要因素。其次,选取白藜芦醇作为叶酸光降解及其诱导的β-乳球蛋白(β-LG)结构变化的抑制剂,通过荧光光谱、HPLC和紫外-可见分光光度计评价了白藜芦醇对叶酸光降解和降解过程的影响,并采用圆二色光谱(CD)评价白藜芦醇对叶酸光降解诱导的蛋白质结构变化的影响。与此同时,通过紫外-可见分光光度计、HPLC和ABTS法研究叶酸光降解对白藜芦醇的转化和降解,以及对其活性的影响。研究发现白藜芦醇可影响叶酸的光降解过程,且与白藜芦醇的浓度和添加时间有关。在照射10μM叶酸溶液前加入1μM的白藜芦醇即可完全抑制叶酸的光降解,但当在光照过程中添加白藜芦醇,则需10μM的浓度才可以抑制10μM叶酸的继续光解。白藜芦醇既可以抑制叶酸光降解形成6-甲酰蝶呤和对氨基苯甲酰谷氨酸的过程,也可抑制对氨基苯甲酰谷氨酸的进一步降解。此外,白藜芦醇可以抑制由叶酸光降解诱导的β-乳球蛋白的结构变化。白藜芦醇在起到保护作用的同时,白藜芦醇的转化和降解被加速,但仍能保留其抗氧化性,并且这一点对于抑制叶酸的光降解起到重要的作用。然后,选取在前期研究中对叶酸保护效果最好的咖啡酸作为另一种活性成分,评价叶酸光降解诱导的蛋白质损伤和咖啡酸抑制蛋白质损伤的能力,探究叶酸光降解诱导的蛋白质氧化机制。采用HPLC和LC-MS定量和定性分析活性成分和主要降解产物,结合ABTS法和前期所得研究结果揭示稳定机制。选取β-乳球蛋白、α-乳白蛋白(α-LA)、牛血清白蛋白(BSA)和β-酪蛋白(β-CS)进行比较研究。研究得出,叶酸光降解导致的蛋白质羰基增加量由多至少的排序为:β-LG>BSA>α-LA>β-CS,蛋白质色氨酸损失量顺序为:BSA>β-LG>α-LA>β-CS,并且导致β-LG和BSA表面和总游离巯基减少,但不改变总巯基含量,即诱导蛋白质分子内或分子间游离巯基和二硫键的交换,而不生成其他氧化产物。叶酸存在时紫外光照240 min后β-LG形成结构展开的非天然单体和二聚体,α-LA以其单体形式损失,BSA则形成寡聚体,并且二级结构含量减少,而β-CS的二级结构未发生变化。三重激发态叶酸和氨基酸通过电子转移途径生成氨基酸阳离子自由基和叶酸阴离子自由基,进一步导致蛋白质的降解、聚集和去折叠。蛋白质、叶酸和咖啡酸共同存在时,三者在光照下的稳定性均有所提高。四种蛋白质复合物对叶酸和咖啡酸的保护作用顺序完全一致,为:β-CS≈α-LA>β-LG>BSA。咖啡酸及其产物,秦皮乙素可通过电子转移途径抑制叶酸光降解及其诱导的蛋白质组成和结构变化。蛋白质本身的抗氧化性对叶酸的稳定性的提高也有所帮助。叶酸通过吸收UVA减少咖啡酸的光降解。秦皮乙素由于其强抗氧化性和吸收UVA特性提高咖啡酸的稳定性。最后,采用磷酸钙(CP)为模板制备壳聚糖包覆的玉米醇溶蛋白空心纳米粒子,与不含CP的实心纳米粒子比较研究两种纳米粒子对水溶性活性成分叶酸和咖啡酸的共包埋作用。在通过红外光谱和荧光光谱研究载体和活性成分的相互作用的基础上,结合超滤离心管离心和超速离心法分析活性成分在载体中的定位和分配。对比研究两种载体对活性成分的稳定性和活性的影响,揭示载体的优缺点。研究发现,制得的空心和实心纳米粒子的粒径分别为169.4 nm和98.1 nm,多分散性系数分别为0.13和0.19,ζ-电位为+41.1 mV和+40.8 mV,粒子粒径均较小且分布均匀,具有很高的胶体稳定性。包埋0.15mM叶酸和/或0.03 mM咖啡酸并不会使空心纳米粒子的粒径增大,而实心纳米粒子的粒径增加到了137 nm。叶酸首先与壳聚糖结合,然后包覆在玉米醇溶蛋白纳米粒子表面,而咖啡酸通过与钙离子的耦合作用被包埋在空心核中。共包埋导致咖啡酸的抗氧化活性被部分掩蔽,但可以提高活性成分的光稳定性。综上所述,抗氧化剂的加入可提高叶酸的光稳定性,各抗氧化剂光照后的活性和对UVA波段的吸收在保护叶酸方面比抗氧化剂本身起到了更重要的作用。抗氧化剂通过电子转移途径抑制由叶酸光降解及其诱导的蛋白质的结构和组成变化。在抑制叶酸光降解及其诱导蛋白质组成和结构变化的同时,白藜芦醇的转化被加速,咖啡酸的光稳定性却显著提高。以磷酸钙为牺牲模板的壳聚糖包覆的玉米醇溶蛋白空心纳米粒子可用于水溶性活性成分的包埋和保护。