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纤维素酶是能将纤维素有效降解成葡萄糖的一组复合酶系的总称,广泛的应用于食品、造纸、纺织等诸多领域。根据纤维素酶的最适p H值的不同,可以将纤维素酶分为三类:酸性纤维素酶、中性纤维素酶、碱性纤维素酶。目前,工业纤维素酶液主要是酸性的,但是纺织水洗工业的洗涤剂是中性或碱性的,且富含阴离子表面活性剂和氧化剂,所以工业洗涤环境中酸性纤维素酶液活性一直很低,且常常使染色的纺织物产生微毛,褪色的现象,洗涤效果一直不理想。Stce1是是内切葡聚糖酶45家族的一个新成员,由日本学者Jinichiro Koga等通过对1600个真菌的培养上清液筛选而得,具有高的除微纤维,抗阴离子表面活性剂和氧化剂活性。目前,Jinichiro Koga等已经成功将stce1转入到腐质霉中,重组的stce1是以一个成熟蛋白的形式在腐质霉中表达,酶活力很高,每毫升培养物上清液中含有0.90毫克目的蛋白,占总蛋白的27%,比在S.Coccosporum上清培养液中的0.0085mg/m L含量高了100倍。本实验室已成功对质粒p PICZαA进行改造获得质粒p PIC-Ppdc-Tpdc,简称p PIC-PT。PCR扩增获得目的基因stce1,测序后与NCBI序列比对,同源性为99%。通过双酶切的方法将目的基因stce1插入到质粒p PIC-PT中,构成表达盒p PIC-PST。然后利用原生质体共转法将表达盒p PIC-PST与含潮霉素B抗性的质粒p AN7-1一起转入到里氏木霉QM9414中,潮霉素B抗性平板筛选阳性转化子,获得重组菌B6。通过对重组木霉B6的发酵培养,获取上清粗酶液,测得其CMCNa酶活力,FPA酶活力分别为2.09 U/m L、0.44 U/m L,相对于里氏木霉QM9414原菌相比分别提高了7.1倍和4.3倍。同时对重组木霉B6进行了酶学性质的初步研究,测得其最适p H值为6,最适温度为60℃。本课题对stce1基因也进行了原核系统的表达。将内切葡聚糖酶基因stce1克隆到表达载体p ET-28a中,形成原核表达盒p ET28-stce1。将原核表达盒p ET28-stce1转化大肠杆菌大肠杆菌Rosetta菌株,获得重组菌A2,然后对重组菌IPTG诱导条件进行探索,得出最佳诱导条件为37℃,4h,IPTG终浓度0.5 m M。测得最终酶活为1.23 U/m L。综上所述,本工作成功构建了中性内切葡聚糖酶stce1的原核表达盒p ET28-stce1,并成功将其在大肠杆菌中得到表达,构建中性内切葡聚糖酶stce1真核表达盒p PIC-PST,并使其在里氏木霉中成功表达,为该基因的进一步研究奠定了基础。