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阿尔巴斯白绒山羊和绵羊作为内蒙古自治区两大主要家畜品种,其胚胎干细胞的建系一直未能成功。成功的建立其胚胎干细胞系对两种家畜的育种以及当代畜牧业的发展具有重大的作用。本研究就阿尔巴斯白绒山羊和绵羊两种动物的胚胎干细胞建系展开研究,采用胎鼠成纤维细胞为饲养层,对比不同的传代方法、不同的培养液对两种动物胚胎干细胞培养的影响,并通过形态鉴定、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色、体外分化检测、PCR鉴定等方法对其进行检测鉴定,为成功的建立大家畜胚胎干细胞系提供实验依据。一、阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的建系(一)前期准备实验1.分别利用自然发情和同期发情的阿尔巴斯白绒山羊母羊进行超数排卵处理,以获得高质量、多数量的体内胚胎。研究结果显示两种方法获得的阿尔巴斯白绒山羊胚胎质量均较高,但卵巢排卵点数量有极显著差异(P<0.01),自然发情母羊超排后每只卵巢排卵点10.6±3.8,明显多于同期发情处理后的母羊每只卵巢排卵点6.1±3.1。自然发情阿尔巴斯白绒山羊母羊更适合于超数排卵体内胚胎的获得。2.通过对4个多能性基因的同源性比较分析,确定了大动物(山羊、绵羊、牛)与人的同源性更相近,与鼠的同源性较远,从而确立了阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养液以人胚胎干细胞的培养液为主,即胚胎干细胞培养液Ⅰ:DMEMF12+10%胎牛血清+0.1mMβ-巯基乙醇+0.1mM非必须氨基酸+0.lmML-Glutamine+20ng/mlLIF+10ng/ml bFGF+100IU/ml青霉素+0.05mg/ml链霉素,和胚胎干细胞培养液Ⅱ:DMEMF12+BSA+N2+B27+0.1mMp-巯基乙醇+0.1mM非必须氨基酸+0.1mM L-Glutamine+100IU/ml青霉素+0.05mg/ml链霉素+20ng/mlLIF+10ng/mlbFGF。3.实验中采用耳缘静脉注射的方法自制了兔抗阿尔巴斯白绒山羊血清,对不同稀释比例的血清进行效价检测,检验测定结果发现以1：5比例稀释的兔抗阿尔巴斯白绒山羊血清与豚鼠血清补体反应充分,是所制备血清的最优效价。(二)培养体系的确立1.以胎鼠成纤维细胞为饲养层,采用培养液Ⅰ和培养液Ⅱ两种液体、通过胚胎直接贴壁获得内细胞团、运用机械传代法和胰酶消化法传代培养阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞,运用90%胎牛血清+10%DMSO的冷冻保护液冷冻保存阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞并复苏培养,对其进行鉴定。结果显示,两种培养液都可用于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养,培养液Ⅱ中胚胎干细胞的生长速度更快,因此,培养液Ⅱ更适合于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养；机械传代法更适合于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的传代培养；两种培养液中培养的阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞经冷冻、复苏后保持着胚胎干细胞的干性特征,即普通的冷冻、复苏方法可有效的保存阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞。2.自制兔抗阿尔巴斯白绒山羊血清用于免疫外科学方法获得阿尔巴斯白绒山羊胚胎内细胞团,以胎鼠成纤维细胞为饲养层,采用培养液Ⅱ、运用机械传代法培养阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞以确定免疫外科学法是否适合于获得阿尔巴斯白绒山羊胚胎的内细胞团。研究结果显示,免疫外科学方法获得的阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞纯度较高,细胞检测结果显示其具有干细胞的全能性特征,即免疫外科学法适合于阿尔巴斯白绒山羊胚胎干细胞的培养。二、绵羊胚胎干细胞的建系培养(一)前期准备实验运用一步法、两步法、波尔山羊冷冻精液法三种方法制备绵羊冷冻精液,结果显示,一步法所获得精液在解冻后精子活力最强,成活率较高,而采用两步法和波尔山羊冷冻精液法所冷冻的绵羊精液,解冻后精液精子活力较低,成活率相对较低。采用一步法获得高质量的绵羊冷冻精液,通过体外受精技术可获得孵化率较高的绵羊胚胎。(二)培养体系的确立1.以胎鼠成纤维细胞为饲养层、采用SESC基础培养液(DMEMF12+10%胎牛血清+O.1mMβ-巯基乙醇+0.1mM非必须氨基酸+20ng/ml LIF+10ng/ml bFGF+100IU/ml青霉素+0.05mg/ml链霉素)、胚胎直接贴壁获得内细胞团、通过机械法传代培养绵羊胚胎干细胞,摸索绵羊胚胎干细胞的培养体系。结果显示普通干细胞培养的技术路线适合于培养绵羊胚胎干细胞,可对其进行较深层次的研究。2.采用培养液Ⅰ和培养液Ⅱ两种不同液体、以胎鼠成纤维细胞为饲养层,通过胚胎直接贴壁获得内细胞团、运用机械传代法培养绵羊胚胎干细胞,比较分析两种培养液对培养绵羊胚胎干细胞的影响,并对其进行鉴定。结果显示,两种培养液都可用于绵羊胚胎干细胞的培养,培养液Ⅱ更利于细胞的生长。