论文部分内容阅读
本研究通过以洋槐蜜为模型建立了蜂蜜蛋白的SDS-PAGE电泳体系,研究了野桂花蜜、枇杷蜜、油菜蜜、荔枝蜜、龙眼蜜和洋槐蜜六种蜂蜜12个样本中蛋白质的相同点和差异性,并进一步研究了蜂蜜中掺入果葡糖浆、油菜蜜掺到其他五种蜂蜜及其他五种蜂蜜掺入到野桂花蜂蜜的蛋白质种类和数量的变化；还利用双向电泳技术对蜂蜜中蛋白质的差异性进行了研究。主要研究结果如下：1.利用凯氏定氮法与沉淀冻干法测定不同蜂蜜(野桂花蜜1、野桂花蜜2、枇杷蜜1、枇杷蜜2、油菜蜜1、油菜蜜2、荔枝蜜1、荔枝蜜2、龙眼蜜1、龙眼蜜2、洋槐蜜1和洋槐蜜2共12个蜂蜜样本)中总蛋白质的含量,结果显示：(1)凯氏定氮法得到12个蜂蜜样本的总蛋白含量依次为：0.97%、0.96%、2.20%、2.20%、0.86%、0.86%、2.17%、2.23%、3.50%、3.60%、1.07%和1.13%。同种蜂蜜之间差异不显著；不同种蜂蜜之间,枇杷蜜与荔枝蜜差异不显著,其他种蜂蜜之间均差异显著。(2)沉淀冻干法得到12个蜂蜜样本的总蛋白质含量依次为：0.19%、0.18%、0.38%、0.29%、0.16%、0.17%、0.29%、0.40%、0.55%、0.53%、0.18%和0.18%。同种蜂蜜之间,枇杷蜜和荔枝蜜的两个样本之间差异显著,野桂花蜜、油菜蜜、龙眼蜜和洋槐蜜四种蜂蜜的两个样本之间差异不显著；不同种蜂蜜之间,野桂花蜜和洋槐蜜之间差异不显著,其他种蜂蜜之间均差异显著。2.从蜂蜜蛋白质提取方法的选择、不同上样缓冲液、蛋白样品的不同超声溶解时间、不同分离胶浓度等方面对蜂蜜蛋白质SDS-PAGE电泳条件进行了优化,从而建立了蜂蜜蛋白的SDS-PAGE电泳体系。结果显示,较优的实验方法是采用硫酸-钨酸钠沉淀法提取2g蜂蜜中的蛋白质,200μL上样缓冲液(100mmol/L1.0M Tris-HCl(pH6.8)、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油、200mmol/L β-巯基乙醇)超声(超声功率200w)溶解10min,12%的分离胶,适宜上样量为5μL。3.通过对6种蜂蜜12个样本进行SDS-PAGE电泳,结果显示：(1)同种蜂蜜的两个样本之间蛋白条带个数基本相同,只是在蛋白含量上略有差异,说明同种蜂蜜的样本之间重复性良好,但不同种蜂蜜之间蛋白质的种类和含量存在差异。(2)6种蜂蜜12个样本的蛋白质分子质量主要分布在16kD-90kD之间,样品的蛋白条带数约为11-17条,它们含有4种相同蛋白,其分子质量依次为64kD、30kD、25KD、16.5kD。(3)6种蜂蜜各有一些含量丰富的蛋白质,为其主要蛋白。野桂花蜜、枇杷蜜、油菜蜜、荔枝蜜、龙眼蜜和洋槐蜜含有的主蛋白种数分别为7种、6种、6种、7种、8种和7种。(4)与其他五种蜂蜜相比,野桂花蜂蜜具有两种特异蛋白,其分子质量分别为49kD和32kD；在野桂花蜂蜜中未发现另外五种蜂蜜中分子质量为52kD(或53kD)和47kD(或48kD)的两种主要蛋白质。(5)对于分子质量为35kD和30kD的两种蛋白质的含量,枇杷蜜明显高于另外五种蜂蜜。(6)油菜蜜的蛋白含量不如其他五种蜂蜜的蛋白含量丰富。(7)荔枝蜜蛋白质分子质量在16.5kD-64kD之间,不含有野桂花蜜、枇杷蜜和洋槐蜜所共有的分子质量为85kD和72kD的两种蛋白质；与其他五种蜂蜜相比,荔枝蜜所具有的分子质量为64kD的蛋白质含量明显高于其他蜂蜜,64kD的蛋白质为荔枝蜜的特异蛋白。(8)龙眼蜜和荔枝蜜均不含有分子质量为57.5kD的蛋白质,龙眼蜜含有分子质量为38kD的蛋白质,而没有荔枝蜜所含有的39.5kD的蛋白质；龙眼蜜不含其他四种蜂蜜(枇杷蜜、油菜蜜、荔枝蜜和洋槐蜜)所含有的分子质量为21kD的蛋白质,可以作为检测龙眼蜂蜜的一种特异蛋白。(9)11号样本洋槐蜜中分子质量为21kD的蛋白质的含量明显高于其他11个样本。4.利用蜂蜜蛋白SDS-PAGE电泳体系,对蜂蜜中不同比例地掺入果葡糖浆,油菜蜜不同比例地掺入到其他五种蜂蜜,及其他五种蜜不同比例地掺入到野桂花蜂蜜进行了研究,结果发现,蜂蜜中某些蛋白条带会随着果葡糖浆或其他蜂蜜比例的增加而原有条带变浅甚至消失,但被添加蜂蜜的蛋白条带会出现。5.利用双向电泳技术对野桂花蜜、枇杷蜜、油菜蜜、荔枝蜜、龙眼蜜和洋槐蜜六种蜂蜜的12个样本进行了研究,研究表明：(1)对于7cm pH3-10的胶条,银染上样量75μg较适宜；(2)蜂蜜蛋白的分子质量主要分布在16kD-90kD,等电点(pI)主要分布在pH3.5-8.5范围内,在分子质量40kD-80kD和pH3.5-7.5区域内的蛋白质含量最为丰富,为蜂蜜蛋白的主要分布区；(3)六种蜂蜜之间,蛋白的分布和不同区域的丰度均有所差异,各种蜂蜜均有其特有的蛋白分布；(4)同种蜂蜜的两个样本之间,蛋白分布情况基本相似,尤其是野桂花蜜和龙眼蜜两种蜂蜜的两个样本之间蛋白分布情况极为相似。因此,利用2-DE技术对蜂蜜蛋白进行研究,为蜂蜜蛋白质数据库的建立提供了有效信息,也为蜂蜜的种类鉴别和蜂蜜的掺假鉴定提供了技术支持。