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【背景】严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种2019年新发的急性呼吸道传染性疾病2019冠状病毒病（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）的病原体[1]。据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）官方网站报道,截至北京时间2022年4月15日下午5点13分,全球超过5亿人感染该病毒,并造成近620多万人死亡,病死率达1.24%;其中,中国累计确诊患者954,346例,死亡患者14,440例,病死率1.51%;美国累计确诊患者79,716,960例,死亡患者979,321例,病死率1.23%。美国死亡的病例数与中国确诊病例数相当。SARS-CoV-2与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）有相似之处,但又截然不同。2020年1月20日,中国政府将COVID-19纳入法定传染病乙类管理,但采取甲类传染病的预防、控制措施[2,3]。由于SARS-CoV-2的突变率相对较高[4],因此,出现了多个变异毒株,如Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron等。SARS-CoV-2的中位R 0值被评估为2.2～8.9,不同的变异毒株其R0值有所差异[5–7]。由高传染性的SARS-CoV-2引发的大流行疫情,已经成为有史以来影响最广泛、最严重的一场全球性疫情。特别是有高度免疫逃逸特性突变株的出现,显著降低疫苗接种的保护能力。【实验目的】目前,检测是否感染SARS-CoV-2主要以实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR）为主,辅以病毒全基因组高通量测序解释病毒的潜在来源、传播链、变异、进化等。核酸检测能够及早检测到处于窗口期的感染者,是新型冠状病毒肺炎患者诊断的“金标准”。与抗体抗原检测相比,基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）技术的耗时费力,且需要专业的技术实验人员操作特定的设备,不适用于居家诊断。核衣壳（Nucleocapsid Protein,N）蛋白是SARS-CoV-2基因组编码最丰富、高度保守的结构蛋白,是作为抗原检测中较为理想的靶点[8]。因此,制备检测SARS-CoV-2（N）蛋白抗原需要的单克隆抗体（Monoclonal Antibody,m Ab）,拟建立SARS-CoV-2（N）蛋白抗原的检测方法。开发一款便捷的居家诊断、检测试剂盒,可避免人员的大量聚集和降低交叉感染的风险,可减少社会资源的投入。【实验方法】本课题采用基因克隆技术将编码SARS-CoV-2（N）蛋白的基因克隆至p ET-28a（+）载体以构建重组质粒p ET-28a（+）-SARS-CoV-2（N）,并将其转化到大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）TSsetta（DE3）中;SARS-CoV-2（N）融合蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖（Isopropyl-beta-D-Thiogalactopyranoside,IPTG）诱导细菌表达,再将其提纯、透析、浓缩后作为抗原（Antigen,Ag）。分别将不乳化和弗氏佐剂乳化的SARS-CoV-2（N）蛋白注射到雌性BALB/c小鼠的腹腔、脾脏、后腿足垫、以及颈背部、腹股沟、腋窝等淋巴较为密集的区域,促进小鼠脾脏、淋巴结的B淋巴细胞对蛋白抗原产生免疫反应,分泌与之拮抗的抗体。以50%聚乙二醇（Polyethylene Glycol,PEG）诱导免疫小鼠脾脏B淋巴细胞与Sp2/0-Ag14发生融合;用HAT选择培养基筛选出杂交瘤细胞;经过间接酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测,获得稳定高分泌针对SARS-CoV-2（N）蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。对获得的杂交瘤细胞株进行核型分析,明确了杂交瘤细胞株具有双亲本遗传信息。测定单克隆抗体的亚型,通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法联合蛋白G（Protein G Agarose Beads）亲和层析法纯化单克隆抗体。SARS-CoV-2（N）基因添加血凝素（HA）标签后克隆至pc DNA3.1（+）载体中,并转染HEK293T。通过ELISA测定抗体的滴度、特异性和亲和力。通过蛋白质印迹（Western blotting,WB）和免疫荧光（Immunofluorescence Assay,IFA）等方法验证单克隆抗体的有效性、特异性及潜在应用价值。为了研究这些单克隆抗体识别的结构域,表达3个截短SARS-CoV-2（N）蛋白的重叠多肽,通过ELISA检测其识别的线性B细胞表位。【结果】1.克隆SARS-CoV-2（N）基因和纯化SARS-CoV-2（N）蛋白为方便纯化蛋白,在SARS-CoV-2（N）蛋白氨基端结构域（Amino-Terminal domain,NTD）前和羧基端结构域（Carboxyl-Terminal Domain,CTD）后分别添加8个组氨酸设计PCR引物;以SARS-CoV-2原始病毒株N蛋白基因优化的序列为模板,PCR扩增SARS-CoV-2（N）基因,构建p ET-28a（+）-SARS-CoV-2（N）重组质粒;p ET-28a（+）-SARS-CoV-2（N）-TSsetta（DE3）工程菌表达的SARS-CoV-2（N）蛋白呈可溶性和包涵体（Inclusion Bodies,IB）两种方式表达。经镍亲和层析柱提纯、1×PBS透析、浓缩后,获得纯度大于98%的SARS-CoV-2（N）蛋白。2.抗SARS-CoV-2（N）蛋白杂交瘤细胞及其单克隆抗体的制备连续冲击免疫前小鼠血清的效价均达到1×10~5,冲击免疫后测得小鼠的血清效价均超过1×10~6。处死小鼠获取小鼠脾脏、分离并收集淋巴细胞,通过杂交瘤技术（Hybridoma Technology）,获得若干杂交瘤细胞。挑选7株抗体强阳性反应杂交瘤细胞,生产单克隆抗体,分别予命名为1C7、1D5、2E11、2G11、3C6、4F10和5E11。这些单克隆抗体均为Ig G1亚类。单克隆抗体的SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色结果显示,两明亮条带分别与Ig G抗体轻链和重链的分子量一致。纯化的抗体在ELISA实验中效价均达到12.5 ng/m L以上,其中2G11超过49pg/m L。3.抗SARS-CoV-2（N）蛋白单克隆抗体的表征细胞融合前,抗原免疫后小鼠血清与瞬时表达携带血凝素（HA）标签SARS-CoV-2（N）融合蛋白的HEK293T细胞裂解液WB实验结果,排除了小鼠抗血清是只针对组氨酸标签的情况。细胞融合后,挑选7种单克隆抗体（1C7、1D5、2E11、2G11、3C6、4F10和5E11）通过ELISA确定了它们可以区分MERS-CoV和HCoV-229E,但与SARS-CoV的N蛋白存在交叉反应。因SARS-CoV不再流行,仍可以认为制备的单克隆抗体对SARS-CoV-2有特异性。重叠肽的ELISA结果显示,三个单克隆抗体（1D5、2G11和5E11）识别的表位可能位于SARS-CoV-2（N）蛋白的NTD;两个单克隆抗体（1C7和4F10）识别的表位可能位于SARS-CoV-2（N）蛋白的CTD;另外两个单克隆抗体（2E11和3C6）可能具有多个抗原表位,它们能同时识别SARS-CoV-2（N）蛋白的NTD和CTD。4.抗SARS-CoV-2（N）蛋白单克隆抗体在ELISA、IFA和WB中的应用7种单克隆抗体的ELISA、WB和IFA均呈阳性反应,但效价和亲和力差异较大,2G11的效价和亲和力最高。【结论】本课题获得7种抗SARS-CoV-2（N）的单克隆抗体,对SARS-CoV-2（N）蛋白具有较好的灵敏度。已有的实验结果表明7种单克隆抗体均可用于ELISA、WB和IFA,但是否可以用于临床,需要进一步验证和开发其潜在应用价值。