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花粉萌发和花粉管生长是开花植物进行有性生殖所必需的生理活动,微丝骨架在这个过程中起着决定性的作用。花粉管作为植物中典型的极性生长细胞,其中的微丝骨架被广泛研究。微丝束对极性细胞的生长至关重要。微丝成束的过程受多种肌动蛋白结合蛋白(actin-binding proteins,ABPs)的调控。Fimbrins,也被称为plastins,是目前为止植物中鉴定出来的唯一一种含有CH-domain的肌动蛋白结合蛋白。拟南芥中共有5个家族成员,命名为AtFIM1-5。已有研究表明AtFIM4和AtFIM5在极性细胞花粉管中大量表达,且均能使单体肌动蛋白组装成更加高级的结构,但二者的具体调控机制和功能联系尚不清楚。因此,鉴定和研究拟南芥中AtFIM4和AtFIM5对花粉萌发和花粉管生长的调控机理对于揭示植物微丝骨架的调节机制具有非常重要的意义,同时也有助于了解微丝骨架在植物有性生殖中的关键作用。在本研究中,我们从生理和体外生化两个方面研究了肌动蛋白结合蛋白AtFIM4和AtFIM5对拟南芥极性细胞花粉管的调节功能,并对二者的功能联系和分工进行了初步的探索。取得的主要研究成果如下:1.生物信息学分析表明AtFIM4和AtFIM5具有较高同源性,且表达谱有重叠现象,但在系统进化树中分属不同的枝干,推测二者在保留家族保守性的同时进化出了不同的功能;2.与野生型相比,T-DNA插入单突变体表型无显著差异,而双突变体则差异显著,主要表现为:花粉萌发率降低、花粉管生长受到抑制、出现较高的畸形比率、荚果变短、且花粉管中肌动蛋白束明显减少。说明AtFIM4和AtFIM5对花粉管内微丝骨架的结构维持至关重要,二者功能缺失会对花粉管的生长产生抑制作用;3.GUS组织化学活性检测分析结果清楚显示了AtFIM 和AtFIM5在花粉管中的表达情况:AtFIM4在花粉萌发后开始表达,而AtFIM5在花粉粒和花粉管生长阶段均有表达;4.体外生化实验结果表明与AtFIM5相比,AtFIM4结合肌动蛋白并使之成束的能力更强,而且AtFIM4和AtFIM5均能抑制微丝解聚药物Lat B对微丝的解聚;同时,激光共聚焦显微镜观察结果表明AtFIM4与AtFIM5都能体外结合微丝,AtFIM4使微丝形成疏松的网状结构,而AtFIM5使微丝形成致密的带状结构;5.为了探索AtFIM5蛋白序列中对微丝成束功能起关键性作用的位点,我们构建了单位点突变蛋白AtFIM5-461和双位点突变蛋白AtFIM5-589,并进行了一系列体外生化实验,结果表明AtFIM5-461并不影响AtFIM5结合微丝的能力,AtFIM5-589则在一定程度上增强了 AtFIM5结合微丝的能力;此外,AtFIM5-461和AtFIM5-589不影响AtFIM5组装微丝的方式。综上所述,本研究运用了分子生物学、细胞生物学及体外生化等方法对AtFIM4和AtFIM5在花粉萌发和花粉管生长中的调控功能进行了探索,我们的研究表明AtFIM4和AtFIM5这两种肌动蛋白结合蛋白在花粉管中微丝束的形成中发挥重要作用,这对于细胞的极性生长非常必要,同时也初步探索了二者在调控花粉管生长中存在的功能上的联系与分工现象。