目的：原发性肝癌（Primary hepatic carcinoma，PHC）是世界上常见的恶性肿瘤之一，发病率在恶性肿瘤中居世界第五位，死亡率居第三位，且我国是肝癌的高发地区之一，肝癌严重威胁着我国人民的健康及生命。肝癌的治疗，主要有手术、化学治疗、射频消融治疗、介入治疗、放疗等。肝切除和肝移植是肝癌最有效的治疗方法。与其他恶性肿瘤相比，肝癌术后复发率较高，且肝移植不能普及，肝癌的手术治疗受到限制。近年来随着三维适型放疗技术的发展，放射治疗已经成为治疗肝癌的重要手段。放疗联合化疗及中医中药治疗疗效更好，它仅次于手术切除，特别是在无法切除的肝癌治疗中发挥着越来越重要的作用。由于放疗对于肿瘤周围的正常组织存在损伤，因此，我们试图通过增加肝癌细胞对放射治疗的敏感性来提高放疗疗效、减少放疗的副作用，改善肝癌患者的预后。一些研究证实辐射可引起多种肿瘤细胞IER5基因表达增加，IER5基因在辐射诱导细胞凋亡中发挥一定作用。转录因子是一群能与基因5′端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的一类蛋白质分子。GCF（GC binding factor）就是一个转录因子，由一个长度为3kb的mRNA编码，广泛存在于人体组织细胞中，在基因表达调控中发挥着重要作用。GCF通过与一些编码表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）的基因的启动子相结合[1]，在体内及体外抑制EGF及EGFR启动子，从而抑制EGF及EGFR基因的转录。本课题组的前期研究显示：在辐射诱导IER5基因表达增高的启动子区域内可能存在与辐射有关的调控元件（TGGCGC、GGCCGT、GCGCACA、CGCGG），以及其各自可能的转录因子（GCF、NFI、TTR_inverted_repeat/GCF、GCF）[2]。核糖核酸干扰（RNA Interference，RNAi）是指由与靶基因同源的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）介导的细胞内mRNA的特异性降解，以致于下调或抑制靶基因的表达，从而产生相应功能表型的缺失。RNA干扰技术，是功能基因分析的重要方法，其中最主要的方法是应用化学合成的小分子RNA（Small interfering RNA，siRNA）进行干扰。细胞从第一次分裂结束开始到第二次分裂结束为止所经历的全过程，称为细胞周期，其包括细胞间期和分裂期。其中细胞间期又分为DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）及DNA合成后期（G2期）；细胞分裂期（M期），又分为前期、中期、后期及末期。细胞周期按G1期→S期→G2期→M期的顺序进行，其中有两个关键的“检定点”： G1/S及G2/M。细胞周期阻滞（cell cycle arrest）是指细胞周期未能通过检定点，进入细胞周期的下一阶段。鉴于目前国内外尚未见有关GCF与IER5关系、IER5转录因子、辐射与GCF的关系的相关研究报道。本课题选择离体培养肝癌HepG2细胞为研究对象，采用RNA干扰技术，转染HepG2细胞，建立GCF基因低表达细胞模型，研究抑制GCF基因表达对HepG2细胞增殖、细胞周期及辐射效应的影响，以及抑制GCF基因表达对HepG2细胞IER5蛋白表达的影响。方法：①采用脂质体2000稳定转染shRNA技术，抑制HepG2细胞GCF基因表达，构建GCF基因低表达HepG2细胞系（GCF-shRNA-HepG2细胞系），采用RT-PCR及免疫印迹法检测GCF基因低表达HepG2细胞系的抑制效率。②分别应用0Gy、2Gy和4Gy⁶⁰Co γ射线照射GCF-shRNA-HepG2细胞和对照组细胞（转染与目的基因序列无同源性的HepG2细胞，NC-shRNA-HepG2细胞），采用细胞计数方法了解细胞生长情况；分别应用0Gy、2Gy⁶⁰Co γ射线照射GCF-shRNA-HepG2细胞和NC-shRNA-HepG2细胞，采用流式细胞术检测细胞周期。③分别应用0Gy、2Gy和4Gy⁶⁰Co γ射线照射GCF-shRNA-HepG2细胞和NC-shRNA-HepG2细胞，采用免疫印迹法检测IER5蛋白表达水平。结果：1本研究成功构建了GCF基因低表达HepG2细胞系，命名为GCF-shRNA-HepG2细胞系。2抑制GCF基因表达，HepG2细胞生长增快，辐射抑制HepG2细胞生长的作用减弱。①未照射情况下（0Gy），与NC-shRNA-HepG2细胞相比，GCF-shRNA-HepG2细胞生长增快（P＜0.05），说明抑制GCF基因表达，能促进HepG2细胞生长，GCF基因有抑制HepG2细胞生长的作用。②2Gy、4Gy⁶⁰Co γ射线照射后，NC-shRNA-HepG2及GCF-shRNA-HepG2生长均减慢（P＜0.05），但是同一辐射剂量下，GCF-shRNA-HepG2细胞较NC-shRNA-HepG2细胞生长增快（P＜0.05），说明辐射能抑制HepG2细胞生长，从而发挥抗肿瘤作用，抑制GCF基因表达，辐射抑制肿瘤细胞生长的作用减弱，提示GCF基因能增强辐射抑制HepG2细胞生长的作用，增强HepG2细胞的辐射敏感性。3抑制GCF基因表达，辐射诱导HepG2细胞发生细胞周期阻滞的时间缩短，对DNA损伤的修复能力增强。①2Gy⁶⁰Co γ射线照射后8小时，与0小时相比，GCF-shRNA-HepG2细胞及NC-shRNA-HepG2细胞G2/M期及S期DNA含量明显增加（P＜0.05），说明照射后8小时两种细胞均出现G2/M期及S期细胞阻滞。②照射后12小时，GCF-shRNA-HepG2细胞S期的DNA含量较8小时明显下降（P＜0.05），与0小时无明显差异（P＞0.05），说明在照射后12小时GCF-shRNA-HepG2细胞S期细胞阻滞基本解除；而NC-shRNA-HepG2细胞在照射后12小时S期的DNA含量较8小时无明显改变（P＞0.05），明显高于0小时（P＜0.05），在照射后12小时NC-shRNA-HepG2细胞S期细胞阻滞仍存在。说明辐射能诱导GCF-shRNA-HepG2细胞及NC-shRNA-HepG2细胞发生G2/M期及S期细胞阻滞，从而发挥抗肿瘤作用，抑制GCF基因表达，能缩短辐射诱导HepG2细胞发生DNA损伤的修复时间，提示GCF基因能削弱细胞对辐射诱导DNA损伤的修复能力，增加细胞的辐射敏感性。4抑制GCF基因表达，IER5蛋白表达量减少，2Gy⁶⁰Co γ射线辐射诱导IER5蛋白表达作用削弱。①未照射情况下（0Gy组）， GCF-shRNA-HepG2细胞较NC-shRNA-HepG2细胞IER5蛋白表达下降，说明抑制GCF表达，能减少IER5蛋白表达，提示GCF基因能上调IER5基因的表达。②与未照射组（0Gy组）相比，2Gy⁶⁰Co γ射线照射后NC-shRNA-HepG2组IER5蛋白表达量增加，而GCF-shRNA-HepG2细胞IER5蛋白表达量无明显变化，说明抑制GCF基因表达，能削弱辐射诱导IER5表达的作用，提示GCF基因能上调辐射诱导IER5蛋白表达的作用。③与0Gy及2Gy⁶⁰Co γ射线照射组相比，4Gy⁶⁰Co γ射线照射后，NC-shRNA-HepG2细胞与GCF-shRNA-HepG2细胞IER5蛋白表达量均增加，但两者无明显差异，说明4Gy⁶⁰Co γ射线照射后，GCF基因无上调辐射诱导IER5蛋白表达的作用，提示随着辐射剂量的增加，GCF基因上调辐射诱导IER5表达作用减弱或消失。结论:1本研究成功构建了GCF基因低表达HepG2细胞系（GCF-shRNA-HepG2细胞系）。2抑制GCF基因表达能促进HepG2细胞生长，削弱辐射抑制HepG2细胞生长的作用，增强辐射诱导HepG2细胞发生DNA损伤修复的能力，降低HepG2细胞的辐射敏感性。3抑制GCF基因表达，能减少IER5蛋白表达量，削弱2Gy⁶⁰Co γ射线照射诱导IER5蛋白表达的作用，且随着辐射剂量的增加，该作用减弱或消失。