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美国白蛾Hyphantria cunea（Drury）属鳞翅目（Lepidoptera）灯蛾科（Arctiidae）昆虫,是一种重要的世界性检疫害虫,也是我国重大入侵害虫之一。由于其寄主范围广、繁殖能力强和传播速度快等特点,对我国森林资源、农林业生产和生态建设造成了严重损失。据国家林业局2018年第3、4号公告显示,我国美国白蛾疫区已涉及全国11个省（区、市）的572个县级行政区。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前研究最成熟、应用最广泛的杀虫微生物,具有特异性强、环境友好和使用便捷等诸多优点,已经成功用于多种重要农林业害虫的防治,但用于美国白蛾防治的报道却相对较少。本研究对本实验室保存的15株Bt野生菌株进行生物活性测定,筛选出5株对美国白蛾具有高效杀虫活性的Bt菌株,分别为G31、GS24、GS31、GS36和GS70。该5株Bt菌株对美国白蛾一龄3 d幼虫的LC50（50%Lethal concentration）值为0.0840.268 mg/mL胞晶混合物,其中GS36菌株杀虫活性最高,LC50值为0.084 mg/mL胞晶混合物;表达晶体蛋白形态主要为大菱形、小菱形和圆球形等。5株菌株均含有多种cry基因且都含有cry1A和cry2A类基因,主要表达约130 kDa和60 kDa蛋白。从Bt菌株GS36中克隆了cry1Ab35基因（GenBank登录号KT692985）,开放阅读框（Openreadingframe,ORF）为3495bp,推测编码1181个氨基酸,编码蛋白分子量为133.6 kDa,等电点为4.74。构建了Bt工程菌HD1Ab35表达Cry1Ab35蛋白,分子量为140 kDa,晶体形态为小菱形。Cry1Ab35蛋白经胰蛋白酶消化,获得60 kDa的活化片段。Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫具有高效杀虫活性,LC50值为4.34μg/mL;对棉铃虫及甜菜夜蛾初孵幼虫杀虫活性较高,LC50值分别为24.31μg/mL和41.87μg/mL。克隆表达了Bt菌株GS36中enhancin-like基因（GenBank登录号MG012232）,开放阅读框为2202 bp,推测编码733个氨基酸,编码蛋白分子量为84 kDa,等电点为6.35,在重组大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达84 kDa蛋白。提取并纯化了粉纹夜蛾颗粒体病毒（Trichoplusia nigranulovirus,TnGV）中约90 kDa的Enhancin蛋白。生物活性测定显示,分别加入20μg/mLEnhancin蛋白和100μg/mL Enhancin-like蛋白可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫的杀虫活性分别提高4.93倍及4.21倍;加入1.0×105 PIBs/mL美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cuneanuclearpolyhedrosisvirus,HcNPV）可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾三龄2 d幼虫的杀虫活性提高11.16倍,单独Enhancin蛋白、Enhancin-like蛋白和1.0×105 PIBs/mL HcNPV对美国白蛾一龄3 d幼虫和三龄2 d幼虫均无杀虫活性。因此,TnGV中Enhancin蛋白、GS36菌株编码Enhancin-like蛋白、HcNPV三种增效因子可显著增加Cry1Ab35蛋白对美国白蛾的杀虫活性。通过配体杂交（Ligandblot）及质谱（Mass spectrometry,LC-MS/MS）分析技术,分离鉴定了美国白蛾幼虫中肠BBMV（Brush border membrane vesicle）上Cry1Ab35蛋白主要结合蛋白氨肽酶N（Aminopeptidase N,APNs）。结合美国白蛾中肠转录组数据,克隆鉴定了5个hcapn基因,分别为hcapn2（KY949254）、hcapn3（KY949256）、hcapn5（KY949257）、hcapn6（KY949258）和hcapn8（KY949259）。5个hcapn基因的开放阅读框分别为2811、3072、2817、2877和2796 bp,分别编码936、999、938、958和930个氨基酸,预测蛋白分子量分别为105、114、106、110和106 kDa。HcAPNs蛋白与已公布的HcAPN1（KP053647）和HcAPN4（KJ013598）蛋白具有相似的结构特征,即N端信号肽序列,谷氨酸锌化氨肽酶GAMEN基序及锌指结合基序HEXXH（X）18E,除HcAPN1和HcAPN6蛋白外,HcAPNs蛋白均具有C端糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol,GPI）锚定位点,均含有多个O-糖基化位点及N-糖基化位点。7个hcapns基因均在美国白蛾幼虫中肠和后肠组织表达量高,美国白蛾幼虫饲喂Cry1Ab35蛋白后,hcapns基因均表现为1224 h表达水平显著上升。利用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统表达了重组HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3、HcAPN4、HcAPN5、HcAPN6和HcAPN8蛋白,分子量分别为130、110、120、115、120、130和120kDa。配体杂交显示HcAPNs蛋白均能与Cry1Ab35蛋白活化片段结合。利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术探索了HcAPNs蛋白在Cry1Ab35蛋白在美国白蛾杀虫机制中的功能。分别用dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn4/-hcapn5/-hcapn6/-hcapn8注射美国白蛾三龄2d幼虫,3 d后靶标hcapns基因表达水平分别下降了91.9%、72.0%、87.2%、64.0%、68.3%、64.0%和67.1%。将注射ddH2O和dsRNA-egfp/-hcapns的幼虫用含有Cry1Ab35蛋白的饲料饲养5 d后,幼虫校正死亡率分别为70.8%、74.5%、51.4%、41.7%、49.6%、61.1%、50.3%、62.5%和63.9%。注射dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn5的幼虫校正死亡率显著低于注射ddH2O及dsRNA-egfp/-hcapn4/-hcapn6/-hcapn8的幼虫校正死亡率。因此,推测美国白蛾中肠HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3和HcAPN5蛋白为Cry1Ab35蛋白潜在的功能受体。