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结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。临床上就诊的大部分患者属于中、晚期结肠癌,预后差。研发新的有效安全的化学防治药物是目前结肠癌等消化道肿瘤防治方面需要迫切解决的问题。5’-甲基硫代腺(5’-methylthioadenosine,MTA)是多胺和蛋氨酸代谢过程中的代谢产物,其代谢前体是S-腺苷蛋氨酸。cFLIP[celluar Fas-associated death domain-like interleukin-1b-converting enzyme(FLICE)-like inhibitory protein]基因为一抑制细胞凋亡的基因。本课题研究MTA对体外培养的正常结肠上皮NCM460细胞系及结肠癌RKO系和Hct116细胞系增殖及凋亡的影响,并研究cFLIP基因在MTA诱导结肠癌RKO和Hct116细胞系凋亡过程中的作用。第一部分MTA对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响目的:研究MTA对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:1)采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色的方法,研究不同浓度MTA对正常结肠上皮NCM460细胞系及结肠癌RKO细胞系和Hct116细胞系的增殖抑制作用。2)采用Hoechst33258染色的方法,研究不同浓度MTA对正常结肠上皮NCM460细胞及结肠癌RKO细胞系和Hct116细胞系的细胞凋亡的诱导作用。3)采用Annexin V-FITC染色的方法,比较MTA、5-氟尿嘧啶、TRAIL对结肠癌RKO细胞系凋亡的影响。结果:1)MTA对NCM460细胞系、Hct116细胞系和RKO细胞系均可产生增殖抑制作用,且这种抑制作用存在剂量依赖关系。同一浓度下MTA对Hct116细胞系及RKO细胞系增殖的抑制作用均明显强于对NCM460系的增殖抑制作用。2)MTA对NCM460细胞系、Hct116细胞系和RKO细胞系均可产生细胞凋亡诱导作用,且这种诱导作用存在剂量依赖关系。同一浓度下MTA对Hct116细胞系及RKO细胞系凋亡诱导作用均明显强于对NCM460系的凋亡诱导作用。3)MTA、TRAIL、5-氟尿嘧啶均可以对RKO细胞系产生细胞凋亡的诱导作用,MTA或5-氟尿嘧啶与TRAIL联合作用均可增强诱导RKO细胞系凋亡的作用。结论:1)MTA可以对结肠癌Hct116细胞系及RKO细胞系产生明显的抑制增殖和诱导细胞凋亡的作用,该作用明显强于MTA对正常结肠上皮细胞NCM460系的作用。2)MTA、5-氟尿嘧啶均可以与TRAIL产生诱导RKO细胞系凋亡的协同作用。第二部分cFLIP基因在MTA诱导结肠癌RKO、Hct116细胞系凋亡过程中作用的研究目的:探讨cFLIP基因在MTA诱导结肠癌RKO、Hct116细胞系凋亡过程中作用。方法:1)采用realtime-PCR技术,在mRNA水平研究cFLIP基因在MTA诱导结肠癌RKO、Hct116细胞凋亡过程中的表达。2)采用Western Blot技术,在蛋白水平研究cFLIP基因及其下游活性Caspase-8蛋白在MTA诱导结肠癌RKO细胞凋亡过程中的表达情况。3)采用基因转染技术,分析cFLIP基因过度表达后,MTA诱导结肠癌RKO细胞凋亡诱导作用。结果:1)MTA作用于结肠癌RKO、Hct116细胞4-16小时之间可以明显的引起cFLIP基因在mRNA水平的明显下调。2)MTA作用于结肠癌RKO细胞6-16小时之间可以明显的引起cFLIP蛋白的明显下调,并可以引起其下游活性Caspase-8蛋白的上调。3)cFLIP基因过度表达后,MTA对结肠癌RKO的凋亡诱导作用受到了明显的抑制。结论:MTA通过下调cFLIP基因,激活Caspase-8蛋白,可能是其诱导结肠癌RKO、Hct116细胞产生细胞凋亡的部分分子机制。