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第一部分 人骨关节炎软骨组织中miR-337-3p和PTEN的表达变化目的:通过测定人骨关节炎软骨组织中miR-337-3p和PTEN表达水平,并进行统计学分析,明确miR-337-3p和PTEN与OA的相关性。方法:取正常软骨组织和OA 软骨组织,qRT-PCR 测定 miR-337-3p 和 PTEN mRNA 表达水平,Westemblot 法测定PTEN蛋白表达水平,并进行统计学分析。结果:和正常软骨细胞相比,OA软骨细胞miR-337-3p表达明显降低,PTEN mRNA表达明显升高,具有统计学显著性差异,P<0.01。相关性分析显示,miR-337-3p和PTEN mRNA水平呈负相关。PTEN蛋白定量测定结果显示:OA软骨细胞PTEN蛋白表达显著升高,具有统计学显著性差异,P<0.01。结论:OA软骨细胞miR-337-3p表达降低,PTEN mRNA表达升高,两者呈负相关;PTEN蛋白表达升高,miR-337-3p可能参与调节OA的发生发展过程。第二部分过表达miR-337-3p促进OA软骨细胞增殖并抑制凋亡目的:通过测定miR-337-3p过表达后OA软骨细胞增殖的相关指标来明确miR-337-3p对软骨细胞增殖的影响。方法:OA软骨细胞过表达miR-337-3p后荧光倒置显微镜下观察软骨细胞密度。MTT法检测细胞活性,从侧面反映细胞增殖的能力。流式细胞术检测细胞周期、凋亡率及Ki-67表达,通过这些反应细胞增殖活性的指标来判断软骨细胞增殖情况。此外,我们采用qRT-PCR检测PTEN mRNA表达水平,Western blot检测PTEN蛋白表达水平及下游效应物蛋白表达水平,明确miR-337-3p对PTEN的调控和对软骨细胞增殖的影响。结果:过表达miR-337-3p后OA软骨细胞密度增加。经MTT法检测细胞显示OA软骨细胞活力增强。流式细胞术检测显示OA软骨细胞停滞在G0/GI期,而miR-337-3p过表达解除了这种阻断作用,促进DNA复制及细胞增殖活性。OA软骨细胞凋亡率(10.75±1.38),过表达miR-337-3p后OA软骨细胞凋亡率(4.38±0.97),凋亡率显著下降,其统计学差异具有显著性意义,P<0.01。同时,通过流式细胞术检测,miR-337-3p过表达后Ki-67(+)OA软骨细胞数明显增加,其统计学差异具有显著性,P<0.01。此外,qRT-PCR检测显示,OA软骨细胞PTEN mRNA相对表达水平(5.13±0.40),过表达miR-337-3p后PTEN mRNA相对表达水平(2.43±0.43),显著下降。Westemblot蛋白检测显示,miR-337-3p过表达后OA软骨细胞PTEN蛋白表达降低,下游磷酸化AKT(pAKT)升高,pAKT/AKT升高。结论:miR-337-3p过表达抑制了 PTEN mRNA及PTEN蛋白表达,促进了 PTEN/AKT通路下游效应物磷酸化,促进软骨细胞增殖,增强了软骨细胞活性,并抑制了软骨细胞凋亡。第三部分miR-337-3p调控PTEN表达目的:通过OA软骨细胞miR-337-3p过表达或表达抑制后检测PTEN mRNA和PTEN蛋白相对表达水平来验证miR-337-3p对PTEN的调控作用,并通过荧光素酶报告基因验证miR-337-3p和PTEN的结合位点和调控关系。方法:OA软骨细胞进行miR-337-3p过表达或表达抑制,采用qRT-PCR检测OA软骨细胞PTEN mRNA相对表达水平,与空白转染的OA软骨细胞进行对照。Western blot检测PTEN蛋白相对表达水平,并进行统计学分析。荧光素酶报告基因验证miR-337-3p和PTEN的结合位点,并对miR-337-3p过表达或表达抑制后的OA软骨细胞进行检测,比较荧光素酶相对活性。结果:OA软骨细胞过表达miR-337-3p后增殖增强。miR-337-3p和PTEN 3’UTR第109-116核苷酸相结合,并且过表达miR-337-3p后软骨细胞PTEN mRNA和PTEN蛋白相对表达降低。miR-337-3p和PTEN呈负性调节关系。结论:miR-337-3p过表达促进OA软骨细胞增殖。miR-337-3p通过与PTEN结合降低PTEN表达,从而激活PI3K/AKT通路,促进下游AKT磷酸化,从而促进软骨细胞增殖。第四部分PTEN通过PI3K/AKT通路调节软骨细胞生长目的:通过Si-PTEN(PTEN siRNA)转染OA软骨细胞并通过转染Si-NC进行对照,分析OA软骨细胞的增殖和凋亡的变化,并且检测下游效应物表达水平的变化,明确PTEN对PI3K/AKT通路的调控作用及对OA软骨细胞生长的影响。方法:流式细胞术分析细胞活性、细胞周期、细胞凋亡及Ki-67阳性细胞相对计数。qRT-PCR检测转染Si-PTEN后的PTEN mRNA表达。Westemblot检测下游AKT及pAKT蛋白表达水平。结果:通过转染Si-PTEN降低OA软骨细胞PTEN表达,激活PI3K/AKT信号通路,使下游效应分子AKT磷酸化增强,促进了软骨细胞的增殖。结论:PTEN是PI3K/AKT通路的重要调节因子,呈负性调节,抑制PTEN表达后激活PI3K/AKT通路,促进下游AKT磷酸化,使OA软骨细胞增殖增强。