猪链球菌病由猪链球菌（Strreptococcus suis）引起的一种重要细菌性传染病。猪链球菌根据荚膜抗原成分的不同,分为33个血清型。其中猪链球菌2型（Strreptococcus suis serotype 2, SS2）作为一种重要人畜共患传染病,’不仅影响着养猪业健康发展,还严重危害着人类的健康。1998年夏季江苏省暴发了人感染2型猪链球菌病,14人死亡。2005年夏季,在四川省资阳市,暴发了人感染猪链球菌病,204人发病,38人死亡。随着猪链球菌2型对养殖业和人类健康危害的日益加剧,最近几年其已成为国内外研究的热点,尤其是关于其致病与免疫机理方面的研究。致病机理方面的研究主要是集中在毒力因子发掘与功能鉴定以及引起脑膜炎的机制。虽然取得了一定的进展,但是仍然有许多问题没有阐明清楚,尤其是毒力因子之间的相互作用调控网络与细菌致病机理方面的相关性等问题。细菌的双组分调控系统（Two-Component Signal Transduction System, TCSTS）在细菌感受外界环境变化,调节自身基因表达方面发挥着重要作用。随着我国猪链球2型05ZYH33和98HAH12菌株全基因组测序的完成,目前已经有15对双组分调控系统被成功鉴定。本实验室构建了其中一对1660hk/rr新型双组分调控系统基因缺失突变株,通过体内外试验证实该双组分调控系统与猪链球菌2型致病性相关。进一步对一些已报道的重要毒力因子进行了荧光定量PCR验证,证实了研究结果的可靠性。然而,关于1660hk/rr双组分调控系统基因缺失后引起细菌致病性下降的分子机制尚不清楚。鉴于以上背景,本课题在前期构建的1660hk/rr双组分调控系统基因缺失突变株基础上,通过基因表达谱芯片,研究了1660hk/rr基因缺失突变株的基因表达情况,结果显示除缺失目的基因外共有249个基因表达发生了变化。其中SSU05₀153基因下调倍数最大,通过BLAST发现SSU05₀153基因编码内皮素转化酶1（ecel）,与真核生物的内皮素转换酶具有较高的同源性。ecel基因对调节生物体内皮素（ET）的生物学活性起着非常重要的作用。大量研究证实内皮素系统代谢功能紊乱与高血压、脂质代谢紊乱、糖尿病及动脉粥样硬化等大量疾病有关。通过构建猪链球菌2型ecel基因缺失突变株,经过体外生物学特性和动物体内毒力试验,研究ecel基因与毒力的关系。当前,猪用商品化链球菌疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗副反应大,另外对其它血清型交叉免疫保护率不高。而使用的C群链球菌弱毒疫苗自然致弱,存在毒力返强的风险。因此,寻找新的疫苗抗原,研制新型安全、高效猪链球菌2型基因工程疫苗显得尤为重要。通过生物信息学分析和同源性比对,发现6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6PGD）基因在多种细菌中非常保守,且文献已经报道肺炎链球菌的6PGD对小鼠能提供40%的免疫保护。因此,本课题以猪链球菌2型SC19菌株为材料,克隆表达了SS2的6-磷酸葡萄糖脱氢酶,开展了其体外活性和免疫原性研究。论文主要研究内容包括：1.双组分调控系统1660hk/rr基因缺失突变株与野毒株的差异表达基因分析根据Geenbank公布的SS2菌株05ZYH33全基因组序列,定制了SS2全基因组表达谱芯片,比较双组分调控系统1660hk/rr基因缺失突变株与野生菌株之间的差异表达基因。结果显示,有89个基因表达下调了2倍以上,其中25个基因下调表达5倍以上；上调2倍以上41个基因中有4个上调了5倍以上。为了获得更多信息,我们进一步统计了差异表达在1.5倍以上的基因。结果有152个基因下调,99个基因上调,占总基因数的11.4%。通过基因变化倍数以及生物信息学分析,我们推测05SSU0153基因（ecel）可能与猪链球菌2型致病性相关。2.ecel基因缺失突变株的构建根据Genbank中公布的SS2的ecel基因即05SSU0153的序列,以SC19菌株DNA为模板,分别克隆ecel基因上游1034bp和下游1041bp并连接到pMD18T载体,构建克隆载体pMD18T-PS和pMD18T-PX。然后逐步用HindⅢ与SalⅠ、SalⅠ与EcoR I酶切pMD18T-PS和pMD18T-PX,同时逐步用同样酶切的自杀性载体pSET4s,两次连接之后得到自杀性质粒pSET4s-0153。将构建好的自杀性重组转移质粒pSET4s-0153电转化到SS2野生菌株SC19中,通过抗生素和温度双重特征筛选,获得05SSU0153基因缺失菌株,命名Δ0153。通过PCR和测序进一步对基因缺失突变菌株进行了鉴定,结果表明突变株构建正确。3.突变株生物学特性的研究将SS2的ecel基因缺失突变株Δ0153在体外连续传代培养,通过PCR鉴定,证明该缺失菌株能够稳定遗传。在液体培养基中培养A0153基因缺失菌株与SS2野生菌株SC19,每小时取样测定菌液吸光值,根据结果绘制生长曲线,结果表明,A0153基因缺失突变株的增殖能力没有发生明显变化,说明ecel基因的缺失对SS2的体外增殖能力无影响。4.突变株对仔猪的致病性将SS2野生菌株SC19与突变株A0153以5×105cfu/ml,1×106cfu/ml和5×106cfu/ml的剂量,通过耳静脉（1m1）分别感染断奶仔猪。感染后每天观察记录仔猪临床症状,记录死亡情况,并通过病理解剖以及组织切片来评价不同菌株致病性的差异。结果显示突变株A0153攻毒后与野生菌株SC19相比,各不同剂量攻毒组临床症状较轻,死亡率显著降低。表明基因缺失突变株Δ0153对仔猪的致病力明显低于野生菌株SC19。5.6PGD蛋白的克隆表达及细菌黏附抑制试验根据Genbank中公布的SS2的6pgd基因序列,设计引物扩增该基因并连接到原核表达载体pET-28a上。将其转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）,经IPTG诱导,得到重组蛋白6PGD,用组氨酸纯化试剂柱纯化。通过Western blot鉴定证实其具有反应原性。重组的6PGD蛋白与Hep2和HeLa细胞相互作用,阳性对照组不加蛋白作用,2小时后,所有试验组加入SS2野生菌株与细胞相互作用。结果显示加入蛋白后SS2对Hep2和HeLa细胞的黏附分别减少了72%和66%。表明6PGD能抑制SC19与细胞的黏附。6.6PGD蛋白对小鼠的免疫保护试验将20只6周龄Balb/C雌鼠,随机分成2组,每组10只。第1组免疫100μL完全弗氏佐剂乳化20μg6PGD蛋白,第2组免疫100μL完全弗氏佐剂为对照组,首免后14d,28d分别进行后二免和三免,剂量和方式同首免。但改为用不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂乳化。三免后10d所有小鼠用2.5×108 CFU （0.2mL）的SC19通过腹腔攻毒。一免前、二免前、三免前以及攻毒前,对小鼠尾静脉负压采血,检测血清抗体效价。攻毒后每天观察并记录小鼠的临床表现和死亡情况。结果显示：重组6PGD蛋白免疫小鼠14天可检测到特异性的抗体,在38天时抗体效价达到较高水平。攻毒后接种佐剂对照组小鼠表现出明显的临床症状,48h内全部死亡,解剖后发现多脏器有出血,从各脏器均能分离到攻毒用菌株。而6PGD蛋白免疫组攻毒后最终80%的免疫小鼠得到保护。攻毒后部分小鼠表现出临床症状。存活小鼠解剖后无明显病理变化,从脏器中不能分离到攻毒用野毒菌株。7.6PGD蛋白对仔猪的免疫保护试验将20头4周龄仔猪随机分成2个试验组,第1组每头肌肉注射500μL完全弗式佐剂乳化500μg6PGD蛋白,第2组每头注射500μL完全弗氏佐剂为对照组,两周后进行二免,二免的剂量和方式与同一免相同。用不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂。二免两周后用1.0×106 CFU（1mL）的SC19通过静脉攻毒。一免前、二免前和攻毒前对每头猪前腔静脉采血,用ELISA检测血清抗体效价。攻毒后的7天内每天观察临床症状。之后处死存活猪,观察病理变化,取组织作病理切片。结果显示重组蛋白免疫组猪14天可检测到特异性的抗体,在28天时抗体效价达到较高水平。攻毒后接种佐剂对照组猪在攻毒后表现明显的临床症状,48h内全部死亡解剖后发现多脏器有充血、出血,从各脏器均能分离到攻毒用菌株。而6PGD蛋白免疫组攻毒后大部分表现临床症状,部分症状较重,48h内死亡20%,部分猪逐渐好转,最终有50%的猪存活。存活猪,大部分脏器中不能分离到攻毒用野毒菌株。