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生物基1,3-丙二醇是制备聚对苯二甲酸丙二醇酯的天然可再生资源,在地毯、工程塑料、服装面料等领域应用广泛。本论文主要围绕如何制备固定化多酶体系及利用其催化甘油生产1,3-丙二醇展开探讨,主要研究内容如下:
1、采用沉降法研究不同分散剂对超细TiO2粉末水溶液分散性能的影响,结果显示分散剂分散效果强弱依次为:甘油>聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通X-100)>乙二醇>烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)。
2、以TiO2/PAM无机-有机杂化凝胶为载体,吸附-絮凝法固定模型蛋白木瓜蛋白酶,并利用正交设计法找出最佳负载工艺。结果显示,固定化过程中,影响负载最因素显著顺序依次为:固定pH>给酶量>吸附时间>固定温度>PAM掺杂量;固定最佳工艺条件为:先在含0.2 g TiO2的纳米凝胶中加入30 mg木瓜蛋白酶,在35℃pH=8.0环境条件下先吸附10 min,再加入0.2 mg PAM絮凝30 min,此时负载率最高可达97.36%。
3、利用粒度测定、zeta电位分析、SEM/EDS及IR的表征手段,分析固定化酶的形貌和作用机制。结果显示:TiO2与木瓜蛋白酶在最适合的pH范围内,静电吸附在固定过程中起主要作用,其粒径在444 nm附近,结构疏松多孔,比表面积比较大,且酶分子在载体中分布均匀,没有明显团聚现象。
4、选用克雷伯杆菌为粗酶制备的菌种来源,确定粗酶提取的步骤依次为:先增殖培养,离心收集菌体;洗涤并称重,加入生理盐水混匀,冰浴环境下超声波破碎、高速冷冻离心后获得粗酶液,再经饱和度50~55%的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐,最后用 pH=7.0~8.0的Tris-HCl缓冲溶液配制成多酶溶液,并4℃冰箱保存。
5、利用TiO2/PAM作为固定载体,吸附-絮凝法共固定克雷伯杆菌粗酶中的甘油脱氢酶、甘油脱水酶及1,3-丙二醇氧化还原酶,并探讨游离酶和固定化多酶体系的酶学性质和酶促动力学。结果表明:固定最适宜pH为7.5,温度为37℃,此时酶的最大负载量和相对酶活可达到104.1 mg/g和95.36%。固定化多酶体系热稳定性和酸碱稳定性都较游离酶有一定的提高,储存稳定性也较好。对比游离酶和固定化酶的动力学分析表明辅因子NAD(H)再生可行,且利用制得的固定化酶催化转化甘油产1,3-丙二醇,反应10 h后,1,3-丙二醇产率最高达到126.3 mmol/L。