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呼吸道病毒是以呼吸道为入侵门户,在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的一类病毒,其引起的呼吸道疾病具有易感性强、传播速度快、较难控制的特点,严重危害了人类的生命健康,并造成巨大的经济损失。本文聚焦于新型冠状病毒和流感病毒两种呼吸道病毒进行病毒感染与致病机制研究。研究表明,感染SARS-CoV-2 Alpha突变株后会诱导N、ORF9b、ORF6等蛋白表达上调,进而增强对宿主天然免疫应答的抑制,帮助病毒免疫逃逸,表明刺突以外部位的突变在SARS-CoV-2病毒进化中也发挥着重要的作用。此外,在SARS-CoV和SARS-CoV-2康复病人的血清中检测到ORF9b的抗体,表明ORF9b在病毒诊断和免疫应答中有着重要意义。因此,解析ORF9b的分子机制十分重要,由此我们开展了本文的第一部分研究。本文的第一部分对可溶表达和包涵体复性两种不同纯化方式获得的SARS-CoV-2 ORF9b进行结构解析,皆为能结合脂分子配体的同源二聚体构象。LC-MS/MS质谱分析发现不同纯化方式获得的ORF9b蛋白的脂分子配体都为单脂肪酸甘油酯。运用LC-MS/MS技术,我们首次鉴定了ORF9b蛋白的8个磷酸化位点。点突变实验和蛋白热稳定性实验表明S50和S53位点对ORF9b二聚体结构的稳定性很重要,且这两个位点保守性高,可能是一个潜在的药物靶点。有研究表明,SARS-CoV-2 ORF9b能够以单体形式和TOM70结合进而抑制固有免疫应答。我们提出,不同构象的ORF9b对应不同的功能,表明ORF9b是一个构象改变（fold-switching）蛋白。具体来说,ORF9b既可采用部分长α螺旋结构以单体形式与Tom70互作进而抑制免疫应答,又可以富含β折叠的二聚体形式结合膜及参与成熟病毒粒子的组装,这是SARS-CoV-2最大化利用病毒基因组的表现。H5Ny进化支和亚进化支禽流感病毒频频报道感染人事件,尤其是包括H5N1和H5N6亚型的2.3.4进化支。最近的2020～2021年H5N8疫情影响了全世界的家禽和野生鸟类。2020年11月,中国黄河库区大天鹅中暴发H5N8疫情,发现数只死亡。2021年2月18日,俄罗斯报道7例人感染H5N8事件。H5Ny的不断进化及其与其它亚型A型流感病毒的重组值得密切关注。H5Ny不断被报道感染人事件,背后的分子机制是什么?带着这个疑问我们开展本文的第二部分研究。本研究中我们选取俄罗斯感染H5N8患者体内分离的毒株A/Astrakhan/3212/2020/H5N8和中国黄河库区大天鹅体内分离的毒株A/whooper swan/Henan/CAS001-K/2020|H5N8来评估H5N8病毒表面糖蛋白HA的受体结合特异性。系统进化树分析表明两种不同来源的毒株都属于2.3.4.4b H5N8亚支,遗传关系紧密。通过蛋白水平表面等离子共振（SPR）、病毒水平ELISA检测等实验,我们发现两株不同来源的H5N8都特异性结合禽受体类似物,并通过X射线晶体衍射解析了 H5与受体类似物结合的分子机制。通过糖点阵实验,我们发现H5N8 HA虽然不具备结合人源唾液酸受体的能力,但已进化出结合更多种类的α2-3唾液酸受体的能力,如Sialyl Lewis X糖,而组织切片免疫荧光染色表明Sialyl Lewis X糖在人气管表面也有分布。SPR实验结果也表明H5N8 HA与Sialyl Lewis X糖的亲和力相较于早期的H5Ny HA显著增高。通过单颗粒冷冻电镜技术解析了 H5N8 HA结合Sialyl Lewis X糖受体的复合物结构,阐明了 H5N8 HA与Sialyl Lewis X糖亲和力增强的分子机制和关键位点。本研究阐明了流感病毒在进化过程中通过增强结合更多种类α2-3唾液酸受体的能力进而感染人的一种新机制,为流感病毒的检测提供了新的指标。综上所述,该论文聚焦于新冠病毒和禽流感病毒的感染与致病机制研究。解析了新冠病毒ORF9b结合脂分子的同源二聚体结构,鉴定出其特异性结合单脂肪酸甘油酯,研究了磷酸化位点对蛋白稳定性的影响,并提出ORF9b是一个fold-switching 蛋白,表明 SARS-CoV-2 在生命周期中运用非常狡猾、经济的方式发挥功能。发现感染人的H5N8病毒仍偏好结合禽源唾液酸受体,并发现HA上K222Q进化使其与Sialyl Lewis X糖的亲和力显著增强,为禽流感病毒的防控预警提供了新思路。