病毒感染宿主后，因病毒种类、致病性、宿主的免疫力等多方面因素的影响，可形成不同的感染状态，主要包括病原体被清除、隐性感染（亚临床感染）、显性感染（临床感染）、病原携带状态、潜伏性感染。目前对于病毒显性感染的研究已有较多的报道，但是关于病毒隐性感染宿主细胞的报道还属罕见。隐性感染是指病原体侵入机体后，仅引起机体产生特异性的免疫应答，不引起或只引起轻微的组织损伤，在临床上不显出任何症状、体征，甚至生化改变，只能通过免疫学检查才能发现。家蚕拟黄斑病毒（macula-like virus，BmMLV）是目前发现的唯一一种能在家蚕和细胞株中造成隐性感染，而又不引起宿主细胞病变及引起传染性疾病的新病毒。但是目前关于BmMLV的隐性感染机制尚不清楚。本研究拟在我们已完成对BmMLV基因组RNA测序基础上，检测家蚕及其细胞对BmMLV的感染应答，探讨BmMLV的隐性感染分子机制以及基于BmMLV载体的转移基因的能力。本研究可为深入理解BmMLV的隐性感染分子机制、病毒与家蚕的互作提供全新的线索，而且也有可能为向家蚕转移基因提供新的技术体系。　　1.BmMLV苏州株(BmMLV-SZ)全基因组测序及生物信息学分析　　采用RT-PCR法分段扩增BmMLV-SZ基因组的cDNA，将所得到的片段与载体连接，分别测序，最后拼接获得BmMLV-SZ基因组RNA全序列。病毒基因组全长6535nt，5’-端57nt为非编码区，3’-端67nt为非编码区（含有polyA22），具有类似于真核生物mRNA的特点。信息学分析结果显示，病毒基因组RNA有三个开放阅读框：ORF1(58-5304nt)，由5247nt组成，编码由1748aa组成的依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）；ORF2(5315-6028nt)，由714nt组成，编码病毒的衣壳蛋白（CP）(238aa）；ORF3(6061-6468nt)，由408nt组成，编码一个p15多肽（136aa）。BmMLV-SZ基因组RNA序列与已公开的BmMLV基因组序列的同源性达99％。感染BmMLV的细胞中可检测到RdRp编码区域发生碱基突变和碱基缺失现象，推测与BmMLV隐性感染家蚕培养细胞有关。基于RdRP和CP氨基酸序列的进化分析结果显示，BmMLV与芜菁黄花叶病毒（Tymoviridae）的家族成员具有高度的相似性，推测BmMLV可能起源于植物病毒。　　2.BmMLV-p15与BmMLV-cp多克隆抗体的制备及P15和CP的亚细胞定位　　将BmMLV的p15和cp基因分别克隆进pET28a(+)构建原核表达载体，用大肠杆菌表达的重组P15和CP蛋白免疫小鼠制备相应蛋白的多克隆抗体。Western blotting证实了所制备的多克隆抗体具有特异性。免疫荧光显示，P15主要定位在细胞质中，细胞核中也有少量分布；CP定位在细胞质中。　　3.BmMLV对家蚕的感染性及温度和营养条件对BmMLV增殖的影响　　家蚕接种BmMLV后，real-time PCR检测各组组织BmMLV的RNA水平，结果显示，在中肠、丝腺、性腺中均可检测到BmMLV的RNA，以中肠组织中的病毒RNA水平最高。不同压力（温度，培养基）条件下，BmMLV在BmN细胞和Sf9细胞中的检测结果显示，37℃高温及在昆虫TC-100培养基中掺入哺乳类细胞培养液可促进病毒的增殖，表明高温及营养条件的改变可影响BmMLV在细胞中的增殖。　　4.sf-9细胞感染家蚕拟黄斑病毒（BmMLV）后转录组学分析　　为了进一步探讨BmMLV对sf-9细胞的隐性感染机制，对正常sf-9细胞和感染BmMLV后的sf-9细胞进行了转录组学分析。在正常sf-9细胞与感染BmMLV后的sf-9细胞的中差异表达基因总共有5670个，其中上调表达差异基因3180个，下调表达差异基因2490个，满足严格t检验的共同表达的差异表达基因有743个，其中上调表达的差异基因有300个，下调表达差异基因有443个。对所有差异表达基因（DEGs）GO富集分析显示，上调表达差异基因主要与物质转运、跨膜运输、细胞自噬等功能相关，下调表达差异基因的主要与蛋白水解、水解酶活性、小分子代谢、负调控凋亡进程等功能相关。差异基因的KEGG富集分析显示，上调表达的差异基因在RNA降解，核糖体的生物发生通路均有富集，下调表达的差异基因在蛋白酶体、由细胞色素P450引起外源物质的代谢通路上有富集。　　5.BmMLV对哺乳动物细胞的感染　　BmMLV起源于植物病毒，其是否能对哺乳动物细胞系造成持续感染目前尚不清楚。本研究着眼于探究BmMLV是否能够跨越动、植物病毒的“边界”实现跨界感染脊椎动物细胞。将BmMLV接种于哺乳动物肺腺癌细胞H1299细胞，real-time PCR检测发现，随着接种后细胞培养时间的增加，细胞中BmMLV水平逐渐减少，5天后一直维持低水平存在，至21天检测基本上检测不到BmMLV。表明BmMLV难以在H1299细胞中长期隐性感染。　　6.基于BmMLV基因组的基因转移载体的构建　　将BmMLV的基因组RNA及其全长单链cDNA转染进Sf9细胞，结果在sf9细胞中可检测到病毒低水平的增殖，证明BmMLV的RNA及全长单链cDNA具有侵染能力。鉴于BmMLV病毒基因组相对较小，容易进行遗传操作；基因组的cDNA具有感染性，基因组不整合到宿主染色体中，可避免因整合而引发的潜在基因突变和随机效应。将全长cDNA质粒克隆进pBlueScript SK载体，建了含有荧光报告基因、不同启动子控制BmMLV全长cDNA的重组病毒载体以及外源基因插入病毒基因组的基因转移载体，期望为后续基因转移病毒载体开发奠定基础。