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目的:砂仁是我国的“四大南药”之一,收载于《中国药典》2015年版一部,来源于姜科植物阳春砂 Amomum villosum Lour.、绿壳砂Amomum villosum Lour.var.Xanthioides T.L.Wuet Senjen或海南砂Amomumlongiligulare T.L.Wu的干燥成熟果实。砂仁属品种众多,临床用药易混淆,药材真伪难辨,道地性药材质量难以保障,严重影响中药疗效,不利于提高药材质量。本研究以砂仁属阳春砂为主要研究对象,采用以分子生物学为基础的DNA条形码技术和ISSR分子标记技术来获取DNA遗传信息差异,构建广东省内阳春砂DNA条形码数据库,研究DNA条形码对砂仁属植物的鉴定能力和用分子标记探究阳春砂遗传多样性,确立鉴别砂仁属的有效条形码及阳春砂居群种植建议,为后续阳春砂的其他研究奠定了基础。方法:1.通过DNA条形码技术分析砂仁遗传信息差异:实地收集141份样品阳春砂基原植物、49份砂仁属混伪品共13个物种为实验样本,通过试剂盒法及其改进法提取总DNA,主要从当前用于植物物种鉴定常用的五种序列条带(ITS2、ITS、psbA-trnH、matK和rbcL)进行分析:以PCR扩增效率、测序成功率、候选序列种内种间变异、序列特征结构、BLAST分析、系统发育树聚类分析等用于砂仁及其混伪品的鉴定。2.基于ISSR分子标记检测技术开展不同居群阳春砂的遗传多样性分析:采用简单序列重复区间(ISSR)分子标记技术对广东省内7个居群共计141株个体的阳春砂样本的遗传多样性进行研究,深入分析阳春砂的遗传结构方式,构建聚类树状图。3.结合实验研究结果,归纳砂仁属的分子鉴定方法及对阳春砂种植建议。结果:1.本研究分析141份样品阳春砂基原植物、49份砂仁属混伪品的五种候选序列条带(ITS2、ITS、psbA-trnH、matK和rbcL),共构建含531条序列的阳春砂DNA条形码文库,同时五个DNA条形码各自对砂仁属13个物种进行鉴别分析,其中ITS2序列鉴定结果最好,具有较大的种内种间距离和较高的物种鉴别率,结合ITS2序列二级结构结构特征可以有效区分阳春砂、绿壳砂、海南砂及其混伪品;ITS序列各物种种内无变异位点,种内遗传距离为0,种间距离在五种条形码中最大;matK序列测序成功率最低,matK、rbcL序列较为保守;五个片段的种间遗传距离平均值都大于种内遗传距离;构建的NJ聚类树中ITS2、psbA-trnH、ITS序列三者鉴别能力较好,因此推荐ITS2序列结合ITS2序列二级结构信息、psbA-trnH序列及ITS序列作为鉴别砂仁属植物的有效条形码。2.基于ISSR分子标记检测技术开展不同居群阳春砂的遗传多样性分析:本研究选用了 6条ISSR引物用于扩增阳春砂的DNA,共扩增出66条条带,其中具有多态性的条带56条,多态性比率为84.84%。每条引物扩平均增出11条带,平均多态性条带在6～14条之间。等位基因数Na范围为1.2879～1.7121,均值为1.4834。有效等位基因数Ne为1.1848～1.4240,均值为1.3115;基因多样性指数H在0.1117～0.2536之间,均值为0.1820。Shannon’s多样性指数Ⅰ为0.1658～0.3816,均值为0.2689;阳春砂物种水平基因多样性指数H为0.1820,Shannon’s多样性指数Ⅰ平均值为0.2689,表明阳春砂具有较高水平的遗传多样性。阳春砂维持一定的遗传多样性,各居群的遗传水平由高到低分别为:ZY(国道路边)>ZJD(钟蕉垌)>GY(地质公园)>MM(电白)>YC(大垌村)>XFC(幸福村)>TK(谭葵村),且大多数遗传变异分布于居群内,居群之间的地理距离和遗传分化程度无相关性。利用GenAlEx6.502和NTSYS 2.10e软件对阳春砂7个居群进行主成分分析和聚类分析,结果表明居群亲缘关系较近,在聚类分析中可以被聚到一起,在遗传相似系数为0.84时明显分组,分为三支。阳春砂居群之间的遗传分化系数Gst为0.4487,遗传分化极大。各个居群之间的基因流(Nm=0.6143)也证实了这一点,这表明居群之间的遗传交流能力不高。3.基于上述研究成果,提出对阳春砂采取以下种植措施:应优先对遗传多样性丰富的G325国道路边的居群(ZY)、钟蕉垌居群(ZJD)和位于阳春市国家地质公园(GY)的居群进行保护,以期尽可能多地保存遗传多样性。同时,鉴于阳春砂种群间的遗传分化显著,应对每个现存的种群都加紧实施原地保护,建议在阳春市增设保护区。结论:本研究采用分子生物学基础的DNA条形码技术和ISSR分子标记技术:采用对五条候选序列条带ITS2、psbA-trnH、ITS、matK、rbcL的扩增测序,确认DNA条形码的鉴定能力。ITS2序列结合其二级结构特点可以用于阳春砂、绿壳砂及海南砂与砂仁属混伪品的鉴定;推荐ITS2序列结合ITS2序列二级结构信息、psbA-trnH序列以及ITS序列作为鉴别砂仁属的有效条形码。在遗传多样性分析上,需要对阳春市的阳春砂居群采取适当的原地保护措施,增加居群之间的遗传交流,提高阳春砂的遗传多样性。