黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)是海南省特有的辣椒品种,随着种植业的不断发展病毒病已成为海南黄灯笼辣椒减产的首要因素。甜椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒,是制约海南辣椒产业发展的主要因素。Potyvirus病毒基因组5’端有1个称作VPg(virus genome linked protein)的基因组连接蛋白,在病毒侵染寄主的过程中VPg和真核翻译起始因子4E(eukaryotie translation initiation factor 4E,eIF4E)相互作用,是完成病毒侵染复制所需。本研究通过克隆黄灯笼辣椒eIF4E家族的4个基因,利用LexA-酵母双杂交体系和双分子荧光互补技术探索PVMV-VPg和黄灯笼辣椒eIF4E家族编码蛋白的相互作用,为通过eIF4E进行基因编辑,获得抗病毒育种的新材料打下基础。具体结果如下:(1)利用生物信息学技术找出eIF4E家族的所有基因,设计引物。以黄灯笼辣椒嫩叶作为实验材料提取RNA,然后用RT-PCR方法扩增4个eIF4E基因的ORF,暂命名为:Cc-eIF4E、Cc-eIF(iso)4E、Cc-eIF4E-Xm、Cc-nCBP9090。序列同源性分析表明,这4个基因可分为3组,Cc-eIF4E和Cc-eIF4E-Xm属于eIF4E基因;Cc-eIF(iso)4E属于eIF(iso)4E基因;Cc-nCBP9090属于一个帽子结合蛋白基因,它们之间的序列一致性为44.23%-74.78%。(2)用本实验室保存的PVMV(海南)分离物作为模板,经过PCR扩增,得到PVMV-VPg基因序列,ORF有573bp,可以编码191个氨基酸。经分析,PVMV(海南)分离物的VPg高度保守,基因序列一致性很高。(3)利用LexA-酵母双杂交系统分别构建了含PVMV-VPg的诱饵载体和含4个eIF4Es基因的激活域载体,并进行自激活和毒性检测。将重组载体转入酵母菌株EGY48,通过营养缺陷型及β-半乳糖苷酶进行筛选,结果表明:PVMV-VPg与Cc-eIF4E和Cc-eIF(iso)4E有不同程度的互作,与Cc-eIF4E-Xm和Cc-nCBP9090没有互作。(4)为进一步验证PVMV-VPg与黄灯笼辣椒eIF4E家族因子的互作,利用荧光双分子互补技术对其进行互作验证。分别构建含PVMV-VPg基因的YC1-VPg载体、含Cc-eIF4 基因的 YN1-eIF4E 载体、含Cc-eIF(iso)4E的 YN1-eIF(iso)4E 载体、含Cc-eIF4E-Xm 基因的 YN1-eIF4E-Xm 载体和含 Cc-nCBP9090基因的 YN1-nCBP9090载体,并分别转入农杆菌细胞,共同侵染烟草瞬时表达,激光共聚焦显微镜观察到PVMV-VPg可分别与Cc-eIF4E和Cc-eIF(iso)4E在烟草细胞中发生互作。本研究结果为PVMV致病机制的研究提供了理论基础,也为通过eIF4E进行基因编辑培育抗PVMV的黄灯笼辣椒新品种提供了重要的基础。