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自2015年以来,我国主要养禽省份暴发了由禽腺病毒4型(Fowl Adenovirus 4,FAdV-4)新基因型引起的肝炎-心包积液综合征(Hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS),鸡群死亡率高达80%,给我国的养禽业造成了巨大的损失。研究表明,高致病性FAdV-4中国分离株与非致病性FAdV-4毒株的全基因序列相比,存在1966bp的自然缺失,主要结构基因fiber1、fiber2、penton和hexon也存在氨基酸的突变。为了探究自然缺失的1966bp、fiberl、fiber2、hexon和penton基因与高致病性FAdV-4毒力的相关性,本研究利用建立的反向遗传技术平台,构建了rHNJZ-ON1/1966、rHNJZ-ON1/fiber2、rHNJZ-ON1/hexon、rON1-HNJZ/fiber2和rON1-HNJZ/hexon五株重组病毒;通过研究五株重组病毒的生物学特性并与亲本毒株比较,初步确定自然缺失的1966bp与高致病性FAdV-4毒力无关,而fiber2和hexon基因与高致病性FAdV-4毒力密切相关;通过构建rHN.JZ-ON 1/fiberl和rHNJZ-ON1/penton重组病毒并对其生物学特性进行研究,进一步确定高致病性FAdV-4的毒力不依赖于fiberl和penton基因;研究的内容包括以下三个方面:1.Fiber2、Hexon、1966bp替换的FAdV-4重组病毒的构建与鉴定本研究利用Redαβ同源重组和ccdB反向筛选技术,将高致病性毒株HNJZ和非致病性毒株ON1中的fiber2或hexon相互替换,并在HNJZ中缺失的1966bp处插入ON1基因组中相应的1966bp,通过限制性酶切分析鉴定得到正确的重组感染性克隆;通过病毒的拯救和连续传代对重组病毒进行遗传稳定性鉴定。结果显示,重组感染性克隆经BamHI酶切后的结果与预期条带相一致;将正确的重组感染性克隆经Pme 1线性化后转染LMH细胞,拯救出重组病毒,经连续传代和序列测定证实所构建的重组病毒rHNJZ-ON1/1966、rHNJZ-ON1/fiber2、rHNJZ-ON1/hexon、rON1-HNJZ/fiber2 和rON1-HNJZ/hcxon具有良好的遗传稳定性。2.Fiber2、Hexon、1966bp替换的FAdV-4重组病毒的生物学特性研究为探究fiber2和hexon基因以及自然缺火的1966bp与高致病性FAdV-4毒力的相关性,本试验比较了重组病毒 rHNJZ-ON 1/1966、rHNJZ-ON1/fiber2、rHNJZ-ON1/hexon、rON1-HNJZ/fiber2和rONl-HNJZ/hexon与亲本毒株HNJZ和ONl的生物学特性差异。先用病毒滴度测定法研究重组病毒与亲本病毒在LMH细胞上的复制动态,结果显示,所有病毒在体外均能良好复制,且具有相似的复制模式:将重组病毒和亲本病毒用相同剂量口服感染3周龄SPF鸡,致病性试验结果显示,rHNJZ、rHNJZ-ON1/1966和rON1-HNJZ/fiber2感染组鸡死亡率为 100%,rON1-HNJZ/hexon 感染组鸡死亡率为 50%,rON 1、rHNJZ-ON 1/fiber2 和rHNJZ-ON1/hexon感染组与对照组鸡无发病和死亡;病理学检查结果显示,rHNJZ、rHNJZ-ON1/1966、rON1-HNJZ/fiber2和rON1-HNJZ/hexon感染组鸡的器官组织均有不同程度的损伤,而rON1、rHNJZ-ON1/fiber2、rHNJZ-ON1/hexon感染组和对照组鸡则没有任何明显的病变;利用实时荧光定量PCR检测感染鸡器官组织中的病毒载量,结果显示,rHNJZ、rHNJZ-ON1/1966、rON1-HNJZ/fiber2 和rON1-HNJZ/hexon感染组的病毒载量显著高于rON1、rHNJZ-ON1/fiber2和rHNJZ-ON1/hexon感染组;所有感染鸡均可以排毒,但感染带有ON 1毒株fiber2或hexon基因的重组病毒的鸡排毒量显著低于其它组。结果表明,自然缺失的1966bp与高致病性FAdV-4的毒力无关,而fiber2、hexon基因与高致病性FAdV-4的毒力密切相关。3.Fiberl、Penton替换的FAdV-4重组病毒的构建和生物学特性研究为进一步研究fiber1和penton基因与高致病性FAdV-4毒力的相关性,将HNJZ毒株中的fiber1和penton基因分别替换为ON1毒株的相应基因,构建重组病毒rHNJZ-ON1/fiber1和rHNJZ-ON1/penton;连续传代和序列测定结果显示,重组病毒遗传稳定良好;将重组病毒感染LMH细胞研究其复制动态,结果显示,重组病毒与亲本病毒HNJZ和ON1具有相似的复制模式;将重组病毒和亲本病毒用相同剂量口服感染3周龄SPF鸡,致病性试验结果显示,rHNJZ、rHNJZ-ON1/fiber1和rHNJZ-ON1/penton感染组鸡死亡率为100%,rON1感染组和对照组鸡不死亡;病理学检查结果显示,rHNJZ、rHNJZ-ON1/fiber1和rHNJZ-ON1/penton感染组鸡的器官组织均有不同程度的损伤,而rON1感染组和对照组鸡则没有任何明显的病变;利用实时荧光定量PCR检测感染鸡器官组织中的病毒载量,结果显示,rHNJZ、rHNJZ-ON1/fiber1和rHNJZ-ON1/penton感染组的病毒载量显著高于rON1感染组;感染鸡均可以排毒,但rHNJZ-ON1/fiber1和rHNJZ-ON1/penton感染组的排毒量显著高于rON1感染组,而rHNJZ-ON 1/fiber1和rHNJZ-ON1/penton感染组之间无明显差异。试验结果显示,高致病性FAdV-4的毒力不依赖于fiber1和penton基因。