研究背景肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)的诊断标准为右心导管检测肺动脉平均压力≥25mmHg(海平面静息状态下)。在临床上,肺动脉高压通常被分为五大类:动脉型肺动脉高压;左心疾病所致肺动脉高压;缺氧和/或肺部疾病所致肺动脉高压;慢性血栓栓塞性肺动脉高压;不明机制肺动脉高压。肺动脉高压患者的症状是非特异的,早期症状并不明显,但随着病情进展和肺循环阻力进行性增高,可出现呼吸困难、活动后气促、疲乏、晕厥、心绞痛或胸痛,晚期会出现右心衰竭的相关症状。有关肺动脉高压的全球发病率文献较少,但我国是人口大国,即便目前PH患病率尚缺乏准确报道,但PH患者并不鲜见。肺动脉高压的诊断分类略微复杂,其中较为常见的类型是左心疾病导致的肺动脉高压和肺部疾病/低氧导致的肺动脉高压。肺动脉高压不易治疗,预后较差,所以肺动脉高压领域仍值得深入探究。我国有众多吸烟人群,再加上近几年来空气污染严重,肺部疾病患者也越来越多。低氧诱导的肺动脉高压(Hypoxia-induced pulmonary hypertension,HPH)属于临床上第3类肺动脉高压,病因包括慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、支气管扩张等等。而慢性肺泡低氧会促进肺血管的收缩和重构,从而导致肺血管阻力的增加和肺动脉压力增高,长此以往,会慢慢发展成为肺心病以至右心衰,难治性和不良预后不言而喻。众多研究表明,慢性低氧刺激会诱导血管收缩、平滑肌细胞增殖、毛细血管前小动脉肌化等等,这些都是促成HPH发生的病理生理机制。而在HPH发展过程中,HIF-1α也起到了重要的作用。HIF-1是具有转录活性的核蛋白,HIF-1α是HIF-1的活性亚基。常氧条件下HIF-1α的特殊残基脯氨酰基和天冬氨酰基会被羟化从而致其失活降解,而在低氧条件下降解受到抑制,致使HIF-1α的水平增高,从而可以上调一些基因的表达。有研究提示HIF-1α可促进PASMCs增殖,加重低氧诱导的肺动脉高压。低氧会导致线粒体产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),随后ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质发生反应,促进了脂质,尤其是多不饱和脂肪酸的氧化,此过程称为脂质过氧化。脂质过氧化会产生许多的氧化产物,例如丙二醛(Malonaldehyde,MDA)和4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE),这些物质会与细胞内的核酸和蛋白相互作用,从而产生加成化合物,导致DNA的损伤和蛋白质的失活。2016年的一项研究发现,4-HNE可促进平滑肌细胞的增殖,然而,毒性醛类能否在HPH中发挥作用还未有人探究。乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是醛脱氢酶的一种,负责催化乙醛氧化为乙酸的反应,是重要的解酒酶。其主要定位于线粒体,可代谢4-羟基壬烯醛、丙二醛等多种毒性醛类物质。关于ALDH2的研究众多,有研究证实,ALDH2可通过清除毒性醛类物质,在缺血再灌注损伤中发挥心肌保护作用,也有研究证实ALDH2对中风的保护作用。而在肺动脉高压领域,有研究证实激活ALDH2可减轻野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压,但ALDH2对低氧诱导的肺动脉高压的作用及潜在机制尚无人探究。研究目的1.探究脂质过氧化在低氧诱导的肺动脉高压模型中的变化。2.探究脂质过氧化产物对低氧诱导的肺动脉高压的作用。3.探究ALDH2对低氧诱导的肺动脉高压的影响。4.探究ALDH2影响低氧诱导的肺动脉高压是否是通过影响平滑肌细胞的增殖而实现的,以及内在的分子机制。研究方法1.实验动物模型的建立(1)基因工程小鼠的获得:ALDH2敲基因小鼠(ALDH2-/-)和ALDH2转基因过表达小鼠(ALDH2-Tg)均通过购买或者赠予方式获取,在本课题组实验室动物房内饲养繁殖。(2)低氧诱导的肺动脉高压小鼠模型建立:选取10周龄左右的成年雄性小鼠进行造模,模型组放在低氧箱(10%O2)中喂养4周。常氧对照组在空气环境下喂养4周。2.细胞模型的建立及实验采用人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)进行实验,由专用培养基进行培养,进行试验时给予ALDH2激动剂(Alda-1)或抑制剂(Daidzin),或者用过表达ALDH2的腺病毒转染后,在常氧(21%O2)或低氧(2%O2)条件下分别培养0、24、48、72个小时。3.探究慢性低氧是否会增加4-HNE等脂质过氧化产物的产生我们将小鼠随机分为2组:①C57BL/6J小鼠+常氧4周;②C57BL/6J小鼠+低氧4周。实验完毕后检测肺动脉高压相关指标,并进行α-SMA免疫组化染色。ELISA法检测血浆中4-HNE和8-iso-PGF2α的水平,TBA法检测血浆和组织中MDA水平,Western blot检测小鼠组织中4-HNE以及三种脂氧合酶(lipoxygenase,LO)的水平。DHE染色检测小鼠组织ROS水平。4.探究HPH模型中代谢毒性醛的酶发生了哪些变化我们将造模后的小鼠肺组织送公司进行了转录组测序,对有统计意义的代谢醛类的酶绘制了热图,并用q-PCR和Western blot的方法验证了 ALDH2的变化趋势,还进行了肺组织免疫荧光双染(α-SMA和ALDH2)。5.探究ALDH2过表达对HPH的作用我们将小鼠分为4组:①ALDH2-Wt小鼠+常氧4周;②ALDH2-Wt小鼠+低氧4周;③ALDH2-Tg小鼠+常氧4周;④ALDH2-Tg小鼠+低氧4周。为了探究激活ALDH2对低氧诱导的肺动脉高压的影响,我们将小鼠分为4组:①C57BL/6J小鼠+腹腔注射DMSO(常氧4周);②C57BL/6J小鼠+腹腔注射DMSO(低氧4周);③C57BL/6J小鼠+腹腔注射Alda-1(常氧4周);④C57BL/6J小鼠+腹腔注射Alda-1(低氧4周)。实验完毕后检测肺动脉高压相关指标,并进行α-SMA免疫组化染色。Western blot检测小鼠肺组织中4-HNE加合蛋白、PCNA、HIF-1α等蛋白水平。6.探究ALDH2基因敲除对HPH的作用我们将小鼠分为4组:①ALDH2+/+小鼠+常氧4周;②ALDH2-/-小鼠+常氧4周;③ALDH2+/+小鼠+低氧4周;④ALDH2-/-小鼠+低氧4周。实验完毕后检测肺动脉高压相关指标,并进行α-SMA免疫组化染色。Western blot检测小鼠肺组织中4-HNE、PCNA、HIF-1α等蛋白水平。7.探究ALDH2是通过内皮细胞还是平滑肌细胞来影响HPH的我们将小鼠分为4组:①C57BL/6J小鼠+AAV1-ALDH2病毒;②C57BL/6J小鼠+AAV1-GFP 病毒;③C57BL/6J 小鼠+AAV2-ALDH2 病毒;④C57BL/6J小鼠+AAV2-GFP病毒。小鼠进行HPH造模,实验完毕后检测肺动脉高压相关指标,并进行α-SMA免疫组化染色。8.探究NAC或外源性4-HNE可否影响HPH的严重程度为探究4-HNE是否为促进低氧诱导的肺动脉高压的关键因素,我们将小鼠分为2组,给药方式为微量泵泵入,剂量为0.19mg/kg/h,为在4-HNE溶解度范围内微量泵所能达到的最大剂量:①C57BL/6J小鼠+vehicle;②C57BL/6J小鼠+4-HNE。NAC为一种抗氧化剂,可清除毒性醛类,为了探究NAC是否能减轻低氧诱导的肺动脉高压,我们将小鼠分为5组,给药方式为灌胃:①C57BL/6J小鼠+vehicle(生理盐水);②C57BL/6J 小鼠+NAC;③ALDH2+/+小鼠+vehicle(生理盐水);④ALDH2-/-小鼠+vehicle(生理盐水);⑤ALDH2-/-小鼠+NAC。小鼠进行HPH造模,实验完毕后检测肺动脉高压相关指标,Western blot检测小鼠肺组织中4-HNE和HIF-1α的水平。9.探究ALDH2是否影响HPASMCs的增殖为探究ALDH2的激活或抑制是否会影响常氧或低氧条件下HPASMCs的增殖,将细胞分成6组:①DMSO+常氧②Alda-1+常氧③Daidzin+常氧④DMSO+低氧⑤Alda-1+低氧⑥Daidzin+低氧。为探究ALDH2过表达是否影响HPASMCs的增殖,将细胞分成4组:①ALDH2腺病毒+常氧②GFP腺病毒+常氧③ALDH2腺病毒+低氧④GFP腺病毒+低氧。为探究4-HNE是否刺激HPASMCs的增殖,我们给予细胞浓度梯度的刺激(0μM、0.1μM、1μM、10μM),并在确定好中间浓度1μM后,预先给细胞加入Alda-1或Daidzin。检测细胞增殖采用CCK8和Edu两种方法。伤口愈合插件用来做划痕实验,检测HPASMCs的迁移。设置低氧时间梯度(0小时、24小时、48小时、72小时),Western blot检测4-HNE和ALDH2的变化。10.探究ALDH2对线粒体分裂的影响及机制为探究低氧或4-HNE刺激对HPASMCs线粒体的影响,将细胞分为四组:①常氧组②低氧组③DMSO组④4-HNE组。为探究Drp1抑制剂Mdivi-1是否影响低氧或4-HNE诱导的线粒体分裂以及细胞增殖,将细胞分为以下六组:①常氧组②低氧组③低氧+Mdivi-1组④DMSO组⑤4-HNE组⑥4-HNE+Mdivi-1组。为探究Alda-1是否会减轻低氧或4-HNE诱导的线粒体分裂,将细胞分成4组:①低氧+DMSO组②低氧+4-HNE组③4-HNE组④4-HNE+Alda-1组。要检测线粒体形态的细胞需种在24孔细胞爬片上,染完mitotracker后可上机进行共聚焦拍摄。我们用低氧或4-HNE刺激HPASMCs细胞,并设置了时间梯度(0小时、0.5小时、1小时、6小时、12小时),Western blot检测细胞中OPA1、MFN1、MFN2、FIS1、Drp1、Drp1 ser616、Drp1 ser637、HIF-1α 的表达水平。研究结果1.慢性低氧会增加4-HNE的产生HPH模型小鼠血浆中4-HNE和MDA的水平增高,肺组织中4-HNE水平增高,血浆中8-iso-PGF2α也有所增加。但小鼠的心脏、肝脏、大动脉组织中4-HNE和MDA的水平并未改变。DHE染色显示HPH模型小鼠肺组织中ROS水平增高。而三种脂氧合酶,在低氧条件下表达也有所增加。2.HPH模型小鼠肺组织中ALDH2表达下调我们将与乙醛代谢相关的5大酶类(醛脱氢酶,乙醇脱氢酶,醛还原酶,醛酮还原酶,谷胱甘肽-S-转移酶)从转录组测序结果中选出,并选择有统计意义的差异基因绘制了热图,结果发现,与常氧组相比,低氧会降低包括ALDH2在内的13个基因的表达,增加ALDH1A1在内的9个基因的表达。而后续Western blot和q-PCR证实了低氧的确会降低ALDH2的表达。免疫荧光也证实了这一点。3.ALDH2过表达可减轻HPH在低氧条件下,ALDH2过表达小鼠相比于对照小鼠,RVSP、RVH、肌化血管的比例均降低;常氧条件下两种小鼠的指标并无变化。而腹腔注射Alda-1的小鼠,各项指标相比于对照组也出现了明显降低。而Western blot结果发现,低氧会增加4-HNE、PCNA、HIF-1α的水平,而ALDH2过表达可降低低氧条件下的 4-HNE、PCNA、HIF-1α 的水平。4.ALDH2敲除可加重HPH在低氧条件下,ALDH2敲除小鼠相比于对照小鼠,RVSP、RVH、肌化血管的比例均升高;常氧条件下两种小鼠的指标并无变化。Western blot结果发现,低氧会增加4-HNE、PCNA、HIF-1α的水平,而ALDH2敲除可增加低氧条件下的 4-HNE、PCNA、HIF-1α 的水平。5.ALDH2是通过平滑肌细胞而非内皮细胞影响的HPHAAV2-ALDH2小鼠相比于AAV2-GFP小鼠,肺动脉高压的各项指标(RVSP、RVH、肌化血管的比例)均有降低。而AAV1-ALDH2小鼠相比于AAV1-GFP小鼠,肺动脉高压的各项指标并无变化。6.NAC可减轻ALDH2敲除小鼠的HPHNAC小鼠相比于对照小鼠,肺动脉高压的各项指标(RVSP、RVH、肌化血管的比例)均有降低,与此同时,肺组织中4-HNE和HIF-1α的水平也有所降低。而给予ALDH2敲除小鼠NAC灌胃后,肺动脉高压也有所减轻。7.激活ALDH2可减轻低氧或4-HNE诱导的HPASMCs增殖CCK8和Edu结果显示,常氧条件下,激活或抑制ALDH2并未改变HPASMCs的增殖,低氧条件下,激活ALDH2可减轻HPASMCs的增殖,抑制ALDH2可加重HPASMCs的增殖。4-HNE刺激HPASMCs的增殖可呈浓度依赖性,而激活或抑制ALDH2也可干扰4-HNE诱导的HPASMCs增殖。同样的,腺病毒转染后ALDH2过表达,可减轻低氧诱导的HPASMCs增殖。划痕实验结果显示,激活ALDH2可减轻低氧诱导的HPASMCs迁移。Western blot结果显示,低氧会降低ALDH2的表达,增高4-HNE的水平,且呈时间依赖性。8.ALDH2可调控低氧或4-HNE诱导的线粒体分裂共聚焦结果显示,低氧或4-HNE会诱导线粒体分裂,而加入Mdivi-1抑制Drp1后,线粒体分裂会受到抑制,Alda-1也可减轻低氧或4-HNE诱导的线粒体分裂。CCK8结果显示,Mdivi-1可减轻低氧或4-HNE诱导的细胞增殖。Western blot结果显示,当用时间梯度的低氧或4-HNE刺激HPASMCs细胞后,Drp1、Drp1 ser616、HIF-1α 蛋白水平增高,而 OPA1、MFN1、MFN2、FIS1、Drp1ser637蛋白水平并未发生变化。而Alda-1激活ALDH2可减轻低氧或4-HNE诱导的HIF-1α增高和Drp1 ser616磷酸化增加。研究结论1.低氧会促进脂质过氧化水平增高,而脂质过氧化水平的增高会促进HPH的发展。2.ALDH2 可减轻 HPH。3.ALDH2通过4-HNE/HIF-1 α/Drp1信号通路调控线粒体分裂和平滑肌细胞增殖。