目的：肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种神经系统变性疾病，其特征为选择性损害运动皮层、脑干及脊髓前角的运动神经元，表现为肌无力、肌肉萎缩、肌束震颤、腱反射亢进及病理征阳性，进行性加重，最终呼吸衰竭死亡。绝大部分的ALS为散发性（90%～95%），约5%～10%的ALS为家族性，约20%的家族性ALS与Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变有关。目前该病发病机制尚不清楚，但随着病情进展突变SOD1蛋白的聚集、泛素阳性包涵体的形成是ALS的两个重要病理特征。突变的SOD1蛋白首先发生错误折叠、构象改变，暴露出蛋白内部的疏水残基，然后激活细胞内的蛋白酶体系统清除错误折叠蛋白，但是此途径只能对单体蛋白的降解起到作用，在一定程度上延缓了蛋白聚集物的形成。随着病程进展，受损蛋白的不断增多，当蛋白酶体系统不足以完全清除这些蛋白的时候，蛋白酶体系统的成分如泛素也将参与聚集物的形成，并捕获受损的细胞器，形成难以降解的包涵体，细胞自噬可以降解具有聚集倾向的蛋白，因此细胞自噬溶酶体系统在SOD1突变的ALS转基因小鼠中对突变蛋白降解起着极为重要的作用。自噬是一种生物长期进化保留下来的、受严格调节的、用于长寿命蛋白质以及细胞器等胞浆成分的降解与循环再利用的生物过程。自噬现象首先在酵母中被发现，后研究发现自噬普遍存在于真核细胞，通过溶酶体吞噬降解自身成分，是细胞内再循环的系统，也是一种重要的防御和应激调控机制，细胞在受到外界条件的刺激（如饥饿）或者其内部条件发生变化（损伤的细胞器和胞质成分积聚）时都可以产生自噬。细胞可以通过自噬和溶酶体降解消化变性衰老的细胞、受损细胞器或变性蛋白质等使之免受细胞内毒物的损伤。自噬主要以细胞成分包括蛋白质和细胞器等在自噬体中分隔，并在溶酶体中降解为特征。总体来讲，自噬被认为是一种非选择性的降解机制。近来的研究表明，自噬在很多生理和病理过程中扮演重要角色，比如对于神经退行性疾病突变蛋白和受损细胞器的清除等。自噬可以调控长寿蛋白和细胞器的降解利用，参与细胞质的重建、维持细胞质的稳定，所以一般认为长半衰期的蛋白、有聚集倾向的蛋白由自噬途径来降解，无特异性，诱导性强。因此，自噬降解途径和ALS的发病可能存在密切关系。本实验应用家族性肌萎缩侧索硬化动物模型（SOD1⁹G93A）转基因小鼠)，研究疾病不同时期自噬相关指标的改变，并以饥饿作为细胞自噬的诱导剂，观察饥饿诱导的自噬增强对ALS转基因小鼠病程不同阶段突变蛋白表达的影响。旨在研究调节自噬在ALS治疗中的可能作用。方法：1实验动物及分组采用SOD1^G93A转基因小鼠及其同窝非转基因对照小鼠，实验期间每天观察动物、称重及评分。将SOD1^G93A转基因小鼠按症状分为症状前期（60天）、症状早期（100-120天）和终末期（130-150天）。60d同窝对照小鼠分别给予禁食0h、6h、12h、24h、48h后取材。不同疾病时期饥饿组分别给予禁食48h。用10%水合氯醛按照350mg/Kg腹膜内注射麻醉，分别以4%多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取材。2免疫组织化学法4%多聚甲醛固定的脊髓腰膨大部位经振动切片机切成厚20μm切片，0.01M PBS溶液漂洗；3%H₂O₂浸泡，封闭组织内源性过氧化物酶；0.3%tritonX-100穿孔；10%马血清室温封闭，分别加入抗p62和抗SOD1抗体，二抗、辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素孵育后，DAB染色，捞片，脱水，透明及封片。Olympus BX51显微镜观察及照相。3共聚焦显微镜法4%多聚甲醛固定的脊髓腰膨大部位用20%蔗糖/4%多聚甲醛溶液浸泡过夜至组织沉底。冷冻环境下使用包埋剂OCT包埋组织，经冷冻切片机切成厚20μm切片，经漂洗、穿孔、封闭、一抗、荧光二抗孵育并再次PBS漂洗后，抗荧光衰减封片剂封片，Olympus FV1000激光共聚焦显微镜观察及照相。4透射电镜法实验小鼠经4%多聚甲醛灌流固定后，准确定位腰髓前角并取材，继续固定于4%戊二醛中。0.1M PB漂洗，锇酸固定。丙酮梯度脱水，包埋液浸透，包埋，超薄切片机切片。醋酸铀和柠檬酸铅染色后经JEM-1230透射电镜观察、照相。5蛋白免疫印迹实验小鼠经麻醉后，新鲜取材，取小鼠脊髓腰段，提取腰髓组织总蛋白，BCA法测蛋白浓度。蛋白上样，SDS-PAGE电泳后转膜，室温脱脂奶粉封闭后，分别加一抗4℃摇床过夜。次日，加入荧光二抗，洗膜，Odyssey红外扫描成像系统扫膜并分析结果。6荧光定量PCR新鲜取小鼠脊髓腰段，液氮速冻后，-80℃保存。提取RNA并反转录后，Stratagene Mx3005P荧光定量PCR仪扩增目的基因。7计量资料用x±s表示，采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。SOD1^G93A转基因小鼠不同时期组与对照组间mRNA及蛋白表达水平的总体比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异，有统计学意义。结果：1免疫组织化学及共聚焦法显示，随着病程进展SOD1^G93A转基因小鼠腰髓前角残存神经元SOD1、LC3II及P62免疫反应性增强，其分布呈明显聚集性。2电镜显示随着病程进展SOD1^G93A转基因小鼠腰髓前角运动神经元中线粒体肿胀及空泡化进行性加重。3蛋白免疫印迹法显示，SOD1^G93A转基因小鼠随病程进展腰髓SOD1、LC3II、P62表达显著增加。4同窝非转基因小鼠给予饥饿干预48h后，腰髓自噬底物蛋白p62表达明显减少。5蛋白免疫印迹法显示，SOD1^G93A转基因小鼠症状前期饥饿诱导自噬后，腰髓突变SOD1蛋白、P62蛋白有减少的趋势，但无统计学意义，线粒体标记物VDAC1表达无明显减少。症状早期给予饥饿干预后，腰髓突变SOD1蛋白、VDAC1和p62蛋白显著减少。终末前期给予饥饿干预后，腰髓突变SOD1蛋白、p62蛋白增高，而VDAC1表达显著减少。6实时荧光定量PCR显示不同时期SOD1^G93A转基因小鼠饥饿后，腰髓突变SOD1的mRNA水平无明显改变，P=0.08＞0.05。结论：家族性肌萎缩侧索硬化动物模型SOD1^G93A转基因小鼠发病过程中，存在突变SOD1聚集、自噬相关蛋白p62和LC3表达增多及线粒体损伤。饥饿诱导的自噬可以增加受损线粒体的降解，但对突变SOD1蛋白的降解与疾病的不同阶段及自噬通路障碍的程度有关，症状早期可减少突变SOD1蛋白表达，但在终末前期反而使突变SOD1蛋白表达增多。提示症状早期应用自噬增强剂可能对突变SOD1蛋白的降解有促进作用，为自噬增强剂在ALS治疗中的应用提供了可供参考的实验依据。