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目的:探究牵张成骨与骨折早期过程中有明显表达差异的mi RNA和其预测的靶基因,对犬BMSCs的成骨分化是否有调控作用,为阐明牵张成骨能够快速成骨的机制提供理论依据。方法:1.犬BMSCs体外分离培养、鉴定:在严格的无菌操作下,从幼犬胫骨骨髓中抽取骨髓血液,通过密度梯度离心法获得骨髓间充质干细胞。鉴定方法:（1）显微镜下观察BMSCs的形态学特点（2）流式细胞术检测BMSCs的表面标记抗原（3）茜素红染色检测细胞内钙结节的形成情况,检测该细胞的成骨向分化能力。2.mi RNA及靶基因的筛选:2.1提取犬牵张组与犬骨折组愈合组织的mi RNA,筛选课题组前期高通量测序结果中表达下调前10的mi RNA,验证在组织中的相对表达量差异。体外培养BMSCs,分为正常组（N）和成骨诱导组（B）,分别提取其1天、3天、5天、7天的mi RNA,进一步筛选与成骨分化相关的mi RNA,进行成骨分化机制研究。2.2结合生物信息学分析和文献复习,预测出mi R-505参与成骨相关的靶基因。使用慢病毒转染分别过表达或抑制该mi RNA,分为4组:（1）过表达组、（2）过表达慢病毒空载体组、（3）抑制组、（4）抑制慢病毒空载体组。检测以上预测靶基因的表达是否受该mi RNA影响。最后通过双荧光素酶报告基因检测实验加以验证。3.mi R-505靶向CRTC1对BMSCs成骨分化的影响:使用慢病毒转染分别过表达或抑制该mi RNA,分为4组:（1）过表达组（505+）、（2）过表达慢病毒空载体组（505+NC）、（3）抑制组（505-）、（4）抑制慢病毒空载体组（505-NC）。通过q RT-PCR、WB、茜素红染色检测各组中靶基因和成骨分化相关指标OCN的表达差异以及该mi RNA对犬BMSCs成骨分化能力的影响。通过CCK8、Transwell实验检测该mi RNA对BMSCs增殖、迁移能力的影响。结果:1.BMSCs体外分离培养、鉴定结果:1.1密度梯度离心法分离培养出的犬BMSCs的原代细胞,24小时后首次换液,其种瓶48小时后可见贴壁,呈短梭形,可见少数细胞集落,5-7天左右,集落扩大、融合,细胞密度达80%-90%时即可传代。镜下见细胞的形态呈梭形,贴壁生长,密集处可呈鱼群状排列。1.2流式细胞仪检测细胞表面标志物CD90、CD44的阳性率分别为97.9%与98.0%,而CD45、CD34的阳性率分别为0.39%与2.11%。以上结果表明,该骨髓间充质干细胞纯度较好。1.3成骨诱导培养基培养21天后,骨髓间充质干细胞能够向成骨方向分化,茜素红染色可见橘红色钙结节。2 mi RNA及靶基因的筛选结果:2.1课题组前期高通量测序结果中表达下调前10的mi RNA中,mi R-505和mi R-551b的表达差异最显著。2.2将BMSCs分为正常组（N）和成骨诱导组（B）,分别培养1天、3天、5天、7天,mi R-505的表达差异最显著。2.3使用生物信息学方法并结合文献,预测CRTC1、E2F2、WNT10B是mi RNA-505可能的成骨相关靶基因。2.4使用慢病毒转染分别过表达或抑制mi R-505,分为4组:（1）过表达组（505+）、（2）过表达慢病毒空载体组（505+NC）、（3）抑制组（505-）、（4）抑制慢病毒空载体组（505-NC）。q RT-PCR结果显示,过表达mi R-505使CRTC1表达量下降,抑制mi R-505使CRTC1表达量上升,具有统计学差异。E2F2、WNT10B的表达统计学差异不显著或者与mi R-505无明显相关性。双荧光素酶报告基因检测实验显示mi R-505能够靶向作用于CRTC1。3 mi R-505靶向CRTC1对BMSCs成骨分化影响的结果:3.1使用慢病毒转染分别过表达或抑制mi R-505,分为4组:（1）过表达组（505+）、（2）过表达慢病毒空载体组（505+NC）、（3）抑制组（505-）、（4）抑制慢病毒空载体组（505-NC）。q RT-PCR结果显示,过表达mi RNA-505后成骨分化相关基因OCN表达量下降,抑制mi RNA-505后成骨分化相关基因OCN表达量上升（p＜0.05）。WB结果显示,过表达mi R-505时,CRTC1、OCN蛋白表达量下降;反之抑制mi R-505时,CRTC1、OCN蛋白表达量上升。茜素红结果显示,抑制mi R-505时钙结节数量较多、分布较广泛。综上所述,抑制mi R-505表达后,BMSCs成骨分化能力有明显提高。3.2 CCK8和Transwell结果显示,mi R-505对犬BMSCs的增殖、迁移能力无显著影响。结论:1犬下颌骨牵张早期较骨折早期高通量测序结果中下调前10的mi RNA中,mi R-505在组织层面和细胞层面均证明与成骨分化有显著关联。同时预测CRTC1为mi R-505成骨相关的靶基因。2 mi R-505可以在基因和蛋白水平负调控CRTC1的表达,同时抑制mi R-505可提高犬BMSCs成骨分化能力,mi R-505可能通过靶向CRTC1影响犬BMSCs的成骨分化。3 mi R-505对犬BMSCs的增殖、迁移能力无显著影响。