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本研究的目的是探究氮共掺杂石墨烯量子点复合物经FR-β对M1型巨噬细胞靶向的作用。主要分为以下三个部分:第一部分氮共掺杂石墨烯量子点复合物的制备与表征目的:使用氮共掺杂石墨烯量子点（Nitrogen-doped Graphene quantum dots,N-GQDs）与叶酸（folate,FA）制备氮共掺杂石墨烯量子点（FA-N-GQDs）复合物,并对其进行表征。方法:1.使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）两种交联试剂与FA混合,在2-吗啉乙磺酸（MES）缓冲液中加入N-GQDs反应,再通过透析纯化得到纯度较高的FA-N-GQDs复合物溶液,取一部分溶液和N-GQDs水溶液使用真空冷冻干燥机将FA-N-GQDs复合物和N-GQDs制成冻干粉,保存于-20℃冰箱中,供后续试验使用。2.将FA-N-GQDs复合物溶液,使用紫外分光光度计进行表征,测定其特征吸收峰,同时测定FA溶液与N-GQDs水溶液的特征吸收峰,并进行比较,验证FA-N-GQDs复合物的合成情况。3.将FA-N-GQDs冻干粉与溴化钾（KBr）混合制成压片,通过红外光谱仪分析其结构,同时制备FA粉末压片与N-GQDs冻干粉压片,分析结构,并与FA-N-GQDs复合物进行比较,验证FA-N-GQDs复合物的合成情况。4.在透射电镜下扫描FA-N-GQDs复合物,观察其微观结构及FA-N-GQDs复合物的合成情况。结果:1.通过比较紫外可见吸收光谱,FA-N-GQDs复合物的紫外特征吸收峰同时包含N-GQDs与FA的特征吸收峰。2.通过比较红外光谱图片,FA-N-GQDs复合物的红外特征吸收峰同时包含N-GQDs与FA的特征吸收峰。3.通过电镜观察可见FA-N-GQDs复合物N-GQDs粘附于FA形成的背景中。结论:1.经表征证实FA-N-GQDs复合物制备成功。第二部分THP-1-M1型巨噬细胞的诱导与其FR-β的表达情况目的:检测THP-1-M0（M0）、THP-1-M1（M1）及THP-1-M2（M2）型巨噬细胞的FR-β的表达情况。方法:1.将THP-1细胞进行换液、传代并冻存备用,镜下观察形态,并与参考图片进行对比。2.取2块六孔板分别标为A板与B板,并做相同处理:将6孔板上的孔分为3个组,每组2个孔,分别分为M0组、M1组与M2组,将处理好的THP-1细胞种于M1组与M2组内,每孔加入一定浓度的佛波酯（phorbol myristate acetate,PMA）溶液,诱导24h后,使THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞,在光学显微镜下观察形态变化后,再向M1组每孔内加入脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）、干扰素（interferon,IFN）-γ诱导细胞24h,使M0型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞;M2组每孔内加入白细胞介素（Interleukin,IL）-4、IL-13诱导细胞24h,使M0型巨噬细胞极化为M2型巨噬细胞;M0组内种入THP-1细胞并加入PMA诱导24h,使其分化为M0型巨噬细胞。诱导后,在光学显微镜下拍摄图片,观察3种巨噬细胞间形态学的差异。3.取出A板,每组取1孔进行流式细胞术,M0组进行CD14抗体流式染色;M1组进行CD80抗体、CD86抗体流式染色;M2组进行CD163抗体、CD206抗体流式染色。4.使用A板剩余3孔内的细胞,每组提取细胞m RNA,3组细胞的m RNA进行PCR检测FOLR2（FR-β）基因的表达情况,以上实验重复3次。5.使用B板,每组提取细胞总蛋白,3组细胞的总蛋白进行Western Blot实验,检测FOLR2蛋白的表达情况,以上实验重复3次。6.将24孔板分为3个组,每组2个孔,分别分为M0组、M1组与M2组,每组内放置细胞爬片。将THP-1细胞均匀种至M0、M1组与M2组内细胞爬片上方,用上述诱导方法将THP-1细胞极化为M0、M1与M2型巨噬细胞,每组取1孔加入FOLR2免疫组化一抗作为试验组,其余作为空白对照组,在光学显微镜下进行观察比较FR-β的染色情况。结果:1.光学显微镜下THP-1细胞、M0型巨噬细胞、M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞之间形态学存在差异。2.M0型巨噬细胞CD14流式染色阳性;M1型巨噬细胞CD80、CD86染色阳性;M2型巨噬细胞CD163、CD206染色阳性。3.PCR检测M0、M1及M2型巨噬细胞之间的FOLR2基因相对表达有差异,M1型巨噬细胞相对表达水平最高。（p＜0.05）4.Western Blot实验检测M0、M1及M2型巨噬细胞之间的FOLR2蛋白表达有差异,M1型巨噬细胞表达水平最高。（p＜0.05）5.免疫组化显示M1型巨噬细胞试验组染色最深。结论:1.THP-1细胞成功极化M0、M1及M2型巨噬细胞。2.M0、M1及M2型巨噬细胞FR-β含量不同,其中M1型巨噬细胞FR-β含量最高。第三部分FA-N-GQDs复合物经FR-β靶向M1型巨噬细胞的研究目的:观察FA-N-GQDs复合物通过FR-β对M1型巨噬细胞靶向的作用及对M1型巨噬细胞靶向的影响。方法:1.将6孔板分为5个组,每组1个孔,分别为M1-FA-N-GQDs复合物组、M1-N-GQDs组、M1-FA-N-GQDs复合物+FA组M2-FA-N-GQDs复合物组及M2-N-GQDs组。用前文所使用的诱导方法将THP-1细胞极化为M1与M2型巨噬细胞。先在M1-FA-N-GQDs复合物+FA组中提前加入FA溶液共培养30min,之后向M1-FA-N-GQDs复合物组、M1-FA-N-GQDs复合物+FA组及M2-FA-N-GQDs复合物组加入FA-N-GQDs复合物溶液共培养;向M1-N-GQDs组和M2-N-GQDs组加入N-GQDs溶液。其中包含M1型巨噬细胞的孔内均加入LPS、IFN-γ来稳定其极化形态,包含M2型巨噬细胞的孔内均加入IL-4、IL-13来稳定其极化形态共培养6h后,弃去培养基,使用PBS洗涤2-3次后,在光学显微镜及荧光显微镜下拍摄图片并观察荧光差异。2.将2个96孔板分为A板和B板,A板内种入THP-1细胞并将其极化为M1型巨噬细胞,并分为7个组,每组4个孔作为4个平行试验,分别为M1 1000组、M1 500组、M1 250组、M1 125组、M1 62.5组、M1 31.3组及M1组（对照组）,组周围一圈的孔内加入细胞培养液,防止液体蒸发并当做空白组。B板内种入VE细胞,采用A板同样分组方法进行分组。将复合物按照分组方式分别配制1000、500、250、125、62.5、31.3ug/ml的终浓度加入至不同分组内,其中包含M1细胞的孔内均加入LPS、IFN-γ稳定其极化形态,共培养24h,再做CCK-8实验。结果:1.荧光显微镜下M1-FA-N-GQDs复合物组可见明显荧光,M1-N-GQDs组、M1-FA-N-GQDs复合物+FA组M2-FA-N-GQDs复合物组及M2-N-GQDs组未见明显荧光。2.随着FA-N-GQDs复合物的浓度增加,VE细胞与M1型巨噬细胞细胞活性均被抑制,且M1型巨噬细胞细胞活性低于VE细胞（p＜0.05）。结论:1.与M2细胞相比,FA-N-GQDs复合物对M1型巨噬细胞上的FR-β具有较好的靶向作用。2.FA-N-GQDs复合物具有良好生物相容性,但对M1型巨噬细胞具有一定毒性。