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斑节对虾(Penaeus monodon)是我国重要的传统养殖虾类,但由于对其性腺发育调控机制的了解不清晰,育种过程中缺乏人工可控的性腺催熟技术,育种技术理论的升级受到制约。因此,了解性腺发育过程中的调节机制,探索发育相关激素的分泌规律及作用机制有重要意义。促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,Gn RH)是一种十到十二肽的神经激素,在动物的繁育中发挥重要作用。为了获知Gn RH的在斑节对虾神经系统中的分泌规律、功能和作用机制,本研究利用组织切片,免疫组化,体外组织培养,反向液相色谱等方法研究了Gn RH在斑节对虾神经系统中的分布及变化,确定了Gn RH对卵巢发育成熟的诱导作用,并初步建立了斑节对虾Gn RH分离纯化的方法。具体研究结果如下:(1)斑节对虾神经系统和卵巢组织结构通过石蜡切片,HE染色的技术研究了斑节对虾神经系统及卵巢的形态学及组织学结构。结果表明斑节对虾神经系统是由脑,围食道神经,胸神经及腹神经节高度愈合而成,脑位于眼柄基部,由前脑,中脑,后脑和相连的神经束组成,脑中神经分泌细胞根据直径分为三类,分别为小型,中型及大型神经分泌细胞,根据在脑中的分布位置分为6-17神经分泌细胞群。在食道下神经,胸腹神各神经节也是由神经纤维及神经分泌细胞组成。斑节对虾卵巢分为六个期,其中成熟期(V期)卵子呈皮质杆状体。卵巢具有自发荧光现象,主要集中于滤泡细胞以及富含卵黄颗粒的次级卵母细胞、成熟卵母细胞的细胞质区域,荧光强度与卵巢发育阶段具有显著正相关性(P<0.01)。可根据荧光强度初步判断卵巢发育分期。(2)Gn RH在斑节对虾生殖发育期神经系统及卵巢中免疫定位利用免疫组化及定量PCR的方法研究了Gn RH在斑节对虾卵巢发育五个时期(II至VI期)中在神经系统及卵巢中的免疫定位,以及在卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原的表达规律。结果显示阳性信号主要分布于脑、胸神经节的一些中型神经分泌细胞群,并且Gn RH免疫阳性在各神经节的神经纤维中普遍分布,同时在次级卵母细胞也检测到免疫阳性。其次,Gn RH-I类似物在斑节对虾III期脑组织中显示较强的免疫阳性,显著聚集在中型神经分泌细胞细胞质中,呈现高表达水平;然而在卵巢中Gn RH-I类似物仅在成熟期V期次级卵母细胞与初级卵母细胞的细胞间隙中发现免疫阳性。定量PCR结果显示在发育不同时期中,肝胰腺卵黄蛋白原m RNA表达趋势与卵巢中不同,提示斑节对虾神经系统分泌Gn RH-I型类似物,诱导卵巢成熟,在此过程中,肝胰腺卵黄蛋白原向卵巢转移。(3)Gn RH体外培养对斑节对虾卵巢发育的影响采用离体卵巢组织培养的方法研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)促性腺激素释放激素(Es Gn RH-I)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)促性腺激素释放激素(Pc Gn RH),多巴胺拮抗物地欧酮(DOM)及神经组织对斑节对虾卵巢发育的调控作用效果。结果表明:50 ng?ml-1 Es Gn RH-I,500 ng?ml-1 Pc Gn RH,0.3μg?ml-1DOM对离体卵巢的发育有明显的刺激作用,显著增大卵母细胞直径(P<0.01),与脑组织,胸神经处理组效果相似;同时组合使用Pc Gn RH和DOM能极显著促进卵母细胞发育(P<0.01)。荧光定量PCR结果显示Pc Gn RH和DOM处理后能显著增加卵黄蛋白原的积累量。说明甲壳类动物Gn RH和DOM均能促进斑节对虾卵母细胞成熟,并具有协同作用。(4)斑节对虾脑组织Gn RH的初步分离纯化采用反向液相色谱的方法对斑节对虾脑组织中Gn RH类似物进行初步分离,调节初步分离的纯化参数,得到理想的分离图谱,并利用Es Gn RH抗体对分组分进行斑点免疫实验鉴定。结果表明,斑节对虾卵巢发育初期即II期和III期,脑组织粗提液分离组分较多,且在优化的条件下,22-26min收集的组分具有免疫阳性,初步确定小量分离纯化方案。该研究为大量纯化并剖析斑节对虾Gn RH氨基酸结构提供数据基础。