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5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid),简称ALA,是生物体内合成四吡咯类化合物的重要前体物质,在农业及医药等领域具有广阔的应用前景。目前,利用微生物发酵法合成ALA已经取得了一定的进展,但是细胞内大量积累的ALA,也会对生物大分子产生毒害作用。利用ALA转运蛋白,加速ALA向胞外的运输,从而降低胞内ALA浓度,是最直接的解决方法。但是目前关于ALA转运蛋白的研究很少,且没有切实可行的方法用于ALA转运蛋白挖掘。ALA过量合成可能改变某些转运蛋白的表达状态,转录组学可以分析细胞中所有基因在特定生理状态下的转录水平。本课题利用转录组学技术,通过对ALA高产菌株与对照菌株的转录组数据进行比较分析,寻找潜在ALA转运蛋白并进行功能鉴定。本课题的主要研究内容和结果如下:(1)首先构建了底盘菌株的质粒稳定系统。利用Red重组技术敲除了大肠杆菌ZDEcA8上的必需基因A,并在质粒上整合A,使得质粒可以稳定存在,确保细胞不会在ALA发酵过程中因丢失质粒造成ALA合成不稳定,引起其它基因转录水平发生变化。(2)其次构建了不产ALA的对照菌株。通过在ALA合成酶活性中心的关键位点引入突变获得了可以正常可溶性表达,对菌体生长没有影响,基本没有活性的ALA合成酶,突变体对菌体生长没有影响,确保不会由于ALA合成酶表达差异在比较转录组分析中引入其他变量。(3)建立了胞内ALA的检测方法,通过检测菌株生长过程中胞内ALA的动态变化,选择ALA浓度显著变化的四个时间点取样,并进行转录组测序,结合TransportDB大肠杆菌转运蛋白数据库,对转录组数据进行分析,预测出可能与ALA转运相关性的基因。(4)通过研究这些潜在的ALA转运蛋白(包括eamA,rhtA)的缺失及过表达对菌株中胞外及胞内ALA积累的变化,确定其在ALA转运中的作用,结果发现EamA、RhtA、EmrYK 参与 ALA 的向外转运 GltIJKL、FliYYecSC、glnHPQ 可能参与 ALA的向内转运。通过本研究发现的ALA转运蛋白为改造ALA工程菌株提供了新的靶点。同时本研究建立的借助比较转录组分析挖掘转运蛋白的方法对发现其它代谢物转运蛋白的研究也具有一定指导意义。