【摘 要】
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IP3R3作为IP3Rs家族中的一员,在调控细胞内质网Ca2+转运发挥重要作用。钙是决定家禽蛋壳品质的制约性矿物元素,蛋壳腺是蛋壳形成的部位,IP3R3可能通过调控家禽蛋壳腺Ca2+分泌进而影响蛋壳质量。为了探讨IP3R3对家禽蛋壳品质和蛋壳腺上皮细胞Ca2+释放的遗传效应,以三穗鸭为试验材料,研究IP3R3基因遗传变异对鸭蛋壳品质的影响、IP3R3基因不同功能结构域过表达对鸭蛋壳腺上皮细胞Ca2
【基金项目】
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国家自然科学基金:IP3Rs通道调控蛋鸭蛋壳品质的效应机制研究（31760663）；
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IP3R3作为IP3Rs家族中的一员,在调控细胞内质网Ca2+转运发挥重要作用。钙是决定家禽蛋壳品质的制约性矿物元素,蛋壳腺是蛋壳形成的部位,IP3R3可能通过调控家禽蛋壳腺Ca2+分泌进而影响蛋壳质量。为了探讨IP3R3对家禽蛋壳品质和蛋壳腺上皮细胞Ca2+释放的遗传效应,以三穗鸭为试验材料,研究IP3R3基因遗传变异对鸭蛋壳品质的影响、IP3R3基因不同功能结构域过表达对鸭蛋壳腺上皮细胞Ca2+分泌的调控效应,取得如下研究结果:1.通过RT-qPCR和PCR产物直接测序法分别检测三穗鸭IP3R3基因m RNA组织表达谱和SNPs,结果表明:在IP3R3基因第8外显子的g.16067 C>T同义突变、第49外显子的g.35195 T>C和g.35207 G>A同义突变以及第50外显子的g.35425 C>A同义突变,共产生5种单倍型和15种双倍型,g.16067 C>T位点对蛋壳厚度的影响达到显著水平（P<0.05）;双倍型H1H1个体的蛋壳厚度最高,双倍型H5H5则最低;IP3R3基因m RNA表达在45周龄三穗鸭11个组织中均存在不同程度的表达,表达丰度依次为蛋壳腺>心脏>脾>腺胃>胰腺>肾>肝>小肠>肺>胸肌>肌胃。2.通过构建IP3R3基因MIR、RYDR-ITPR-1、RYDR-ITPR-2、RIH-assoc、Ion-trans功能结构域表达载体,pcDNA3.1（+）-Flag-结构域和p EGFP-N3-结构域,转染EK-293T细胞和鸭蛋壳腺上皮细胞,免疫荧光标记对IP3R3基因功能结构域进行亚细胞定位,结果显示:构建的载体能成功转染细胞,5个功能结构域均定位在EK-293T细胞和鸭蛋壳腺上皮细胞的细胞核和细胞质。3.利用pcDNA3.1（+）-Flag-结构域表达载体转染鸭蛋壳腺上皮细胞,CCK8试剂盒检测转染细胞的增殖,结果显示:IP3R3基因5个功能结构域过表达均对鸭蛋壳腺上皮细胞的增殖具有抑制作用,RIH-assoc功能结构域的抑制效应最强。4.利用pcDNA3.1（+）-Flag-结构域表达载体转染鸭蛋壳腺上皮细胞,Fluo-3/AM荧光标记法对Ca2+进行负载,结果表明:IP3R3基因5个功能结构域的过表达均引起鸭蛋壳腺上皮细胞内Ca2+含量显著低于空白对照组（P<0.05）,揭示5个功能结构域过表达均能促使鸭蛋壳腺上皮细胞内Ca2+释放,RIH-assoc功能结构域过表达对鸭蛋壳腺上皮细胞内Ca2+释放影响最强。5.通过研究IP3R3基因5个功能结构域在鸭蛋壳腺上皮细胞中过表达对9个Ca2+转运相关基因CALB1、ITPR1、ITPR2、KCNJ15、PRKCA、SCNN1G、SLC4A4、SLC4A9、TRPV6 m RNA表达的影响,结果显示:MIR结构域过表达量与CALB1、ITPR1、PRKCA和SLC4A9的表达量呈负相关,与其他基因的表达量呈正相关;RYDR-ITPR-1结构域过表达量与CALB1、SCNN1G、SLC4A4和SLC4A9的表达量呈负相关,与其他基因的表达量呈正相关;RYDR-ITPR-2结构域过表达量与ITPR2、KCNJ15和SCNN1G表达量呈负相关,与PRKCA表达量呈显著正相关（P<0.05）,与SLC4A4表达量呈显著负相关（P<0.05）;RIH-assoc结构域过表达量与KCNJ15、SLC4A4、SLC4A9和TRPV6表达量呈负相关;Ion-trans结构域过表达量与ITPR2、SCNN1G和SLC4A9表达量呈负相关;空白组中IP3R3基因表达量与CALB1、PRKCA、SLC4A4和TRPV6基因表达量之间呈负相关,揭示IP3R3基因5个功能结构域过表达调控鸭蛋壳腺上皮细胞Ca2+向胞外转运的机制存在差异。
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