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果胶酸裂解酶可用于香料油和类胡萝卜素等医用原料的提取,咖啡和茶的发酵,含有果胶质废水的处理以及原油的提取过程。近年来又发现了果胶酸裂解酶还可用于植物病毒的纯化、纸浆漂白和以纺织品的生物精炼等。
利用PCR技术从耐热梭状芽孢杆菌Clostridiumstercorarium中扩增得到产耐热果胶酸裂解酶的结构基因pel9A,并将其克隆于表达载体pET28a中,构建表达型重组质粒pPel9A。将此重组质粒转化到受体菌EcoliBL21中进行表达,经37℃培养2h,在0.8mmol/L的IPTG存在下,于37℃诱导5h,经SDS-PAGE分析表达的蛋白质的分子量为130kDa,与预期分子量相符。细胞经超声破碎,测的果胶酶的比酶活为15U/mg粗蛋白。对质粒稳定性的研究表明,EcoliBL21(pPe19A)在无选择压的情况下37℃连续转接5次,质粒丢失率仅为15%,说明质粒基本稳定。
通过单因素和正交试验,优化得到用于培养重组菌E.coliBL21(pPel9A)产酶培养基组成为葡萄糖10g/L,硫酸铵2g/L,蛋白胨2g/L,柠檬酸1.0g/L,磷酸二氢钾12.5g/L,MgSO4·7H2O1g/L,氯化钠2g/L,TES5mL/L,pH为7.0。经优化后,摇瓶培养得到菌体量为2.696g/L(DCW)。在5L台式搅拌发酵罐中,研究了补加碳源对重组菌生长的影响。控制溶氧在30%以上,初始葡糖糖10g/L,在对数生长期补加10g/L的葡萄糖,培养至8h,菌体量达到6.388g/L(DCW),果胶酸裂解酶活性为35U/mL培养液。
粗酶液经HiTrapChelatingHP镍亲合柱和Supedex200凝胶柱进行了纯化。对部分纯化的耐热果胶酸裂解酶的酶学性质研究表明,其最适pH为7.0,将酶液在不同pH缓冲液中于4℃处理12小时后测定的酶活表明其在pH5~9范围内稳定,酶的最适温度为65℃,温度稳定范围为40~75℃。不同的金属离子对酶活的影响不同,Fe2+能完全抑制酶的活性,Mg2+、K+、Co2+、Ni2+和Na+对酶活有不同程度的抑制作用,Ca2+在0.01~0.2mmol/L的范围内对酶有明显的激活作用,最高的激活浓度为0.05mmol/L。