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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)成功应用于昆虫害虫的防治已经有五十多年的历史,但Bt对线虫的防治研究却较少。全世界每年由于植物寄生线虫危害造成的损失估计有800亿元。此外,目前的杀线虫剂危害环境、造价高、应用困难,所以为了克服这些缺点,近些年开始研究Bt对线虫的防治。
本文利用PCR.方法检测了本室保藏的874株Bt,发现有4株带有cry6A基因。对其中的一株Bt 96860-8的cry6A基因进行了克隆和表达。测序结果已经提交到GenBank(DQ257287)。核苷酸序列对比发现被克隆的cry6A基因是cry6Aa2。以秀丽线虫为供试线虫对Cry6A进行杀线虫生物活性测定,结果表明其具有较高的杀线虫活性,毒力约为38.35 ng/cm<2>。
通过生物信息学的分析结果,我们推测Cry6Aa2的N端和C端各有一个水解活化位点,可能与其有活性的毒性核心片段的产生有关。此外,Cry6Aa2被预测的在其毒性核心内的两个二硫键也可能与其毒力有关。据此我们构建了Cry6Aa2的7个点突变体。生测结果表明,与Cry6Aa2相比,分别破坏了N端和C端水解活化位点的突变体R11T和L382I杀线虫活性显著降低,N端和C端水解活化位点同时突变的突变体R11T&L382I毒力更是极显著降低;一个半胱氨酸的突变体C402G、C404G、C451G毒力均无显著变化,而双半胱氨酸的突变体C402G&C404G杀线虫活性显著提高。