背景与目的遗传性牙本质疾病(Hereditary Dentin Defects)是一种常见的人类牙本质遗传性疾病,主要局限于牙乳头跟牙齿中胚层发育异常的一类疾病,其发病率为1/10000-1/6000。早在1973年,Shields将牙本质发育不全分为两大类：遗传性牙本质发育不良(Dentin Dysplasia, DD)与牙本质发育不全(Dentinogenesis Imperfect, DGI);5小类(2类牙本质发育不良与3类牙本质发育不全)。本实验主要研究牙本质发育不良Ⅰ型(DD-Ⅰ)。DD-I (OMIM:125400)是一种罕见的染色体显性遗传疾病,外显率不足100%,发病率为1/100000[2]。临床检查显示为牙冠形态、色泽表现正常,牙本质形成缺陷和髓腔闭塞,经常伴有根尖X线透射。Ballschmiede在1920年对这种疾病进行了相应的描述,他将来自于同一个家庭的7个小孩牙齿牙根短钝、牙齿自然脱落现象称之为条件性“无牙根性牙齿”[3]。斑马鱼的牙齿和人类以及其它哺乳动物在结构上类似,拥有牙髓腔、牙本质和类牙釉质。在牙齿附着期间存在釉器,发育期和人类牙齿发育期相似,有蕾状期、帽状期、钟状期,但斑马鱼牙齿发育周期短、过程简单。在基因调控方面,斑马鱼中调控牙齿发育的基因大部分在人类中都有相应的同源基因,如BMPs、FGF, Alk8、Pitx2a、Dlx, Pax9等多个基因。另,能谱分析、扫描电镜比较成年斑马鱼牙齿与人类16周龄胎儿牙胚的矿化程度和Ca、P比例,发现两者相似度极高。在组织和超微结构上,斑马鱼的牙齿也和人类牙齿相似性很高。因此,选择斑马鱼作为牙齿发育研究的模式生物。目前对于DD-Ⅰ型的相关致病基因的研究仍然是个迷,为解决这一难题,本课题组对一个河南郑州的中国人家系进行了相关基础研究。利用连锁分析、全基因组测序和sanger测序等方法证实VPS4B基因突变导致DD-Ⅰ型疾病,为DD-Ⅰ型疾病诊断提供分子学依据。通过对VPS4B基因的分析,阐述了VPS4B基因突变的致病机理。在细胞水平,利用VPS4B过表达与si-RAN敲降实验对牙齿发育相关经典通路-WNT5A经典通路中的相关基因的调控作用进行分析,为以后阐明牙齿发育机理提供重要的信息。利用斑马鱼这一模式生物,以斑马鱼的牙齿发育系统作为模型,采用“敲低表达”和“过量表达”的方法结合"rescue"实验,初步研究了vps4b基因在斑马鱼牙齿发育过程中的功能作用。材料与方法：1.对一个中国河南郑州的中国人DD-Ⅰ家系采用连锁分析,全基因组外显子测序、sanger测序以及限制性内切酶酶切验证等技术方法,确定致病基因与突变位点。家系样本DNA采用酚／氯仿方法提取,RNA使用TRIZOL与试剂盒提取(RNeasy Mini Kit. Qiagen),然后用去gDNA逆转录试剂盒转录为cDNA。2.使用高分辨率熔炼曲线(High Resolution Melting, HRM)技术筛查当地人群300份随机样本,确定VPS4B基因IVS7+46C>G的突变频率。3.VPS4B基因的时空表达谱：利用RT-PCR确定VPS4B基因在人不同组织、细胞系以及不同时期的小鼠脑组织表达谱。组织与细胞系总RNA使用TRIZOL提取,然后用去gDNA逆转录试剂盒转录为cDNA。扩增产物直接测序确定。4.剪切突变验证：设计特异的转录本扩增引物,利用家系病人与正常人逆转录好的cDNA,使用RT-PCR胶图结合Sanger测序确定剪切突变。5.利用Olig7设计相应的特异性引物,采用荧光定量PCR技术,检测家系中正常人与病人牙龈组织细胞中VPS4B基因总转录水平的差异以及病人外牙龈组织细胞中发生剪切突变后形成的异常转录本与正常转录本转录水平的差异。6.蛋白空间结构预测,用Swiss-Model.软件对野生型与突变型的VPS4B蛋白的三维空间结构进行预测,SOPMA对野生型与突变型的VPS4B蛋白的二级结构进行预测。7.将人类VPS4B基因正常转录本与异常转录本的cDNA克隆到载体pcDNA3.1+-FLAG上,然后利用lipo2000转染试剂按说明转染到已培养好的HEK-293T细胞中,转染后24小时收集细胞,提取总蛋白,利用WestemBlot技术检测野生型蛋白与突变型蛋白之间以及共转后蛋白表达之间的差异。8.亚细胞定位：将人类VPS4B基因正常转录本与异常转录本的cDNA克隆到载体pEGFP-C1上利用lipo2000转染试剂按说明转染到已培养好的COS7细胞中,转染后24小时用DAPI染核技术染核,于荧光显微镜下观察拍照,比较野生型蛋白与突变型蛋白在细胞中表达部位的差异。9.将人类VPS4B基因正常转录本的cDNA克隆到载体pcDNA3.1+上,委托广州锐博生物科技有限公司ribobio合成siRNA-VPS4B序列,分别利用lipo2000转染试剂按说明转染到培养好的Human Gingival fibroblasts(HGF)细胞中,使其过表达或表达降低,转染后24小时使用TRIZOL提取RNA,然后用去gDNA逆转录试剂盒转录为cDNA,过表达试验中pcDNA3.1+空载转染作实验对照,敲降试验中使用广州锐博生物科技有限公司提供的VPS4B-Control转染作实验对照。采用荧光定量PCR技术检测VPS4B过表达与低表达对牙齿发育相关基因WNT5A、WNT5A受体CHMP4B与WNT5A经典信号通路中β-catenin的转录水平的影响。10.使用茜素红染色观察斑马鱼牙齿的发育,用于实验研究。11.利用NCBI的BLAST在线比对软件,搜寻人类VPS4B在斑马鱼中的同源基因vps4b,并对它们的相似性进行比较分析。12.使用RT-PCR确定斑马鱼中vps4b基因的表达,设计并构建合成斑马鱼vps4b基因反义RNA探针,使用整体原位杂交技术分析vps4b基因的时空表达谱。13.委托美国GeneTools公司设计并合成两段针对该斑马鱼基因的morpholino oligonucleotides;其中MO-1的作用在于抑制基因的表达、翻译,MO-2则能够干扰转录本的正常剪切并可能最终得到长度异常的靶基因转录本,指导翻译出长度及序列异常的蛋白质分子。14.将人类VPS4B基因克隆到载体pCS2上,然后用SP6体外转录试剂盒合成该基因的mRNA。15.通过显微注射将morpholino和人VPS4B的mRNA分别单独以及共同导入斑马鱼的受精卵；通过RT-PCR检测人类VPS4B在斑马鱼中的同源基因在morpholino作用下其mRNA水平的改变。16.显微注射后观察鱼卵的生长发育情况,并计数其中牙齿产生缺陷的胚胎以及正常的胚胎,并计算缺陷率和牙齿正常的率。17.设计并构建合成斑马鱼早期牙齿发育相关基因反义RNA探针,使用整体原位杂交技术分析斑马鱼vps4b基因敲降后对斑马鱼早期发育相关基因dlx2b、 bmp2a、wnt5a、hoxb5a、pitx2表达的影响。结果：确定突变位点：通过对DD-Ⅰ家系遗传图谱分析,该家系DD-Ⅰ遗传方式为显性遗传,进一步对家系成员连锁分析、全基因组外显子测序、直接DNA序列测定和限制性内切酶酶切验证确定,结果显示：位于病人的Chr18q21.2-Chr18q21.33区域VPS4B基因第7号内含子区的第46位发生C>G的杂合突变即ⅣS7+46C>G, flag:CACT C TGTCG→CACT G TGTCG。突变频率筛查,选取当地人群300份随机外周血样本,DNA提取后采用HRM技术与测序分析,结果显示：该人群中未发现该位点突变。VPS4B时空表达谱：提取人不同组织以及细胞系的总RNA,小鼠E7、E11、E15、E17、P1、P3、P7、P10、P15、P16、Adult脑组织不同时期的总RNA, RT-PCR,结果显示：VPS4B基因在人不同组织中以及细胞系中都有表达,小鼠脑组织的不同时期均表达。致病机理与蛋白功能分析：提取家系正常人与病人牙龈组织细胞总RNA,设计特异的转录本引物,RT-PCR后胶图结合sanger测序确定,结果显示：突变后在VPS4B基因IVS7+46位置形成一个新的剪切位点,从而形成一个新的转录本(VPS4B-MUT)。在VPS4B基因转录形成的两个转录本的公共区域设计荧光定量PCR (RTFQ-PCR)引物,取正常人Ⅱ-1、Ⅲ-8,病人Ⅱ-2、Ⅳ-6 cDNA,采用RTFQ-PCR,结果显示：正常人Ⅱ-1、Ⅲ-8比病人Ⅱ-2、Ⅳ-6牙龈组织细胞中总转录本转录水平高(p<0.001)。设计两对特异的RTFQ-PCR引物,使其只能单一扩增出正常转录本(VPS4B-WT)或异常转录本(VPS4B-MUT),选取病人Ⅱ-2、Ⅳ-4、Ⅲ-7、Ⅳ-5 cDNA,采用RTFQ-PCR,结果显示：病人牙龈组织细胞中正常转录本的转录水平比异常转录本高(p<0.001),异常转录本的转录水平随年龄呈增多趋势。Wiss-PdbViewer 4.1.0软件对野生型与突变型VPS4B蛋白的三维空间结构预测结果显示：突变型与野生型相比较,突变型VPS4B蛋白在无规转角区域插入15aa(264-278位),第132-134位由无规转角转变成β折叠,237-239位无规转角转变成α螺旋。SOPMA对野生型与突变型的VPS4B蛋白的二级结构预测结果显示：两者除了在氨基酸序列长度上改变,还使250AA之后的二级结构发生了改变；突变型与野生型相比,二级结构中α螺旋和β折叠区域均比例降低了,无规卷曲区域则增加了约3%。构建好的pcDNA3.1+-FLAG-VPS4B-WT与pcDNA3.1+-FLAG-VPS4B-MUT表达载体分别转染,以及共转染HEK-293T细胞后,WesternBlot结果显示：VPS4B野生型蛋白表达水平比突变型蛋白水平高,共转的两种蛋白总表达水平比突变型蛋白高。构建好的pEGFP-C1-VPS4B-WT载体与pEGFP-C1-VPS4B-MUT载体分别转染COS7细胞,转染后24小时DAPI染色,结果显示：VPS4B-WT蛋白在细胞质与细胞核均有表达,VPS4B-MUT细胞核内不表达,只在细胞质中表达。pcDNA3.1+-VPS4B-WT表达载体转染HGF细胞过表达与siRNA-VPS4B转染HGF细胞敲降实验,结果显示：VPS4B过表达使CHMP4B、WNT5A与B-catenin表达量升高,VPS4B敲降后使CHMP4B、WNT5A与β-catenin表达量降低。人类vps4b基因与斑马鱼中vps4b基因蛋白具有88%同源性,cDNA序列75%同源。提取斑马鱼1-5dpf的总RNA, RT-PCR,结果显示：vps4b在斑马鱼胚胎发育早期有表达,进一步确定它们在胚胎中的表达部位,不同发育时期的胚胎整体原位杂交实验,结果显示：vps4b在斑马鱼腮弓处表达。设计并合成vps4b morpholino,显微注射后结果显示：注射vps4b的morpholino后可引起斑马鱼牙齿发育异常vps4b-MO与人VPS4B mRNA共注射结果显示异常可被人野生型的vps4b mRNA显微注射挽救。单独注射vps4b mRNA后斑马鱼牙齿的发育没有明显影响。注射vps4b的morpholino后,结果显示：斑马鱼早期牙齿发育相关基因dlx2b、 bmp2a、wnt5a、hoxb5a表达降低,pitx2表达部位发生改变,由两侧向中间聚集。结论：通过对DD-Ⅰ家系人员基因组的外显子测序、STR连锁分析等几种不同方法分析,发现一种世界首报的VPS4B突变IVS7+46C>G,成功阐明该突变为一种深度内含子区的剪切突变。利用RT-PCR展现了VPS4B在人的不同组织细胞系以及老鼠不同时期的脑组织的稳定表达,确定了VPS4B的时空表达谱—广泛表达；在牙龈与下颌组织中的表达,表明VPS4B基因与人的牙齿发育密切相关。在DD-Ⅰ家系中,RTFQ-PCR检测,正常人牙龈组织中VPS4B总转录水平较病人高,病人牙龈组织细胞中VPS4B正常转录本转录水平较异常转录本高,且随年龄的增长呈增多的趋势,该病病情可能与年龄存在一定关系。通过软件对野生型蛋白与突变型蛋白三维空间结构与二级结构进行预测,发现突变型蛋白三维空间结构与二级结构较野生型蛋白发生较大的改变。通过亚细胞定位技术,确定野生型蛋白在细胞胞质、胞核都表达,突变型蛋白只在细胞质内表达。另外突变型蛋白在体外细胞中表达水平较野生型蛋白、共转蛋白低,分子量比野生型蛋白大1.7KDa,说明该蛋白在患者体内能稳定存在。整个转录、表达水平的变化提示导致牙齿缺陷的机制可能为单倍型剂量不足。通过在Human Gingival fibroblasts(HGF)细胞中的过表达与敲降实验,VPS4B基因与CHMP4B结合,促进WNT5A表达,抑制GSK3β促进β-catenin磷酸化,进而通过β-catenin调节牙齿相关基因的表达,调节牙齿的发育。提示VPS4B基因通过牙齿发育相关通路WNT5A经典信号通路影响牙齿发育。利用RT-PCR证实人类VPS4B在斑马鱼中的同源基因vps4b在斑马鱼胚胎发育早期即有表达；通过原位杂交确定了vps4b在斑马鱼的鳃弓处有表达,而斑马鱼作为硬骨鱼的一种,口腔中没有牙齿,而是在第5鳃弓上长有咽齿。原位杂交的结果表明vps4b可能在斑马鱼的牙齿发育过程中发挥一定的作用。vps4b的反义morpholino寡聚核苷酸注射后引起斑马鱼牙齿发育缺陷,其中vps4b-MO2在斑马鱼胚胎中可降低与人类vps4b同源的基因Vps4b的正常mRNA水平,产生了部分大小异常的mRNA。Rescue实验结果显示：人类野生VPS4B mRNA可达到拯救vps4b-MO1和vps4b-MO2导致的牙齿缺陷的效果。这进一步证明了,人类VPS4B基因在斑马鱼中的同源基因vps4b在斑马鱼的牙齿发育过程中可能起到关键作用。进一步实验发现：vps4b的反义morpholino寡聚核苷酸注射后使斑马鱼牙齿早期发育相关基因dlx2b、bmp2a、wnt5a、hoxb5a表达降低,pitx2表达部位发生改变,提示vps4b基因参与牙齿发育调控途径。过量表达人野生VPS4B mRNA和突变VPS4B mRNA对斑马鱼牙齿的发育没有明显影响,表明,该基因导致牙齿缺陷的机制可能为单倍型剂量不足。