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水飞蓟宾（silibinin）是一种天然黄酮类化合物,从奶蓟（Silybum marianum（L.）Gaertn）的种子中提取分离得到。在临床上,水飞蓟宾被用作治疗肝病的传统药物。目前,酒精性肝病已成为肝脏损伤的主要原因,其预防和治疗是目前亟需解决的医学任务。乙醇进入机体后,通过代谢产生毒性产物乙醛。本研究使用永生化的肝癌细胞（HepG2）和永生化的肝细胞（HL7702）作为体外模型,考察水飞蓟宾对乙醇或乙醛引起的肝细胞损伤的保护作用及机制。MTT实验结果表明,在HepG2和HL7702细胞中,乙醇（50-150 mM）或乙醛（100-400 μM）可降低细胞存活率,而水飞蓟宾（2.5 μM）则可发挥保护作用,提高细胞存活率。通过Western blotting实验可知,乙醇或乙醛可诱导肝细胞发生凋亡,而水飞蓟宾抑制凋亡,发挥保护作用。线粒体是细胞中重要的供能细胞器,可通过分裂和融合维持动态平衡。那么在乙醇或乙醛诱导肝细胞损伤中,线粒体分裂和融合可能发挥着怎样的作用有待进一步探究。通过实验发现,水飞蓟宾抑制乙醇或乙醛诱导的线粒体分裂,维持线粒体数目的稳定。而加入线粒体分裂抑制剂时,则可降低由乙醇或乙醛诱导的肝细胞损伤,加入水飞蓟宾后可进一步降低凋亡率。我们的研究结果表明乙醇或乙醛可以在HepG2和HL7702细胞中通过促进线粒体分裂而诱导细胞损伤,而水飞蓟宾抑制线粒体异常分裂发挥保护作用。乙醇或乙醛虽然可以明显降低肝细胞的存活率（抑制率可达50%左右）,但是乙醇或乙醛诱导肝细胞的凋亡率并不是非常高（凋亡率仅25%左右）。这个现象引起我们的思考,接下来本实验对乙醇或乙醛诱导肝细胞死亡的方式进行考察。加入各种死亡的抑制剂,观察到凋亡抑制剂（ZVAD）、坏死抑制剂（Nec-1）和铁死亡抑制剂（Fer-1）均可以在一定程度上抑制乙醇或乙醛诱导的肝细胞损伤。铁死亡抑制剂可明显对抗由乙醇或乙醛导致的肝细胞损伤,因此可以猜测,乙醇或乙醛诱导的肝细胞损伤中,铁死亡也可能参与其中。Fer-1和水飞蓟宾可进一步降低由乙醇或乙醛导致的ROS、MDA和Fe离子水平升高的现象。铁死亡是依赖于铁离子发挥作用的,因此检测了铁转运蛋白受体（TFR1）和储铁蛋白（Ferritin）的变化。实验结果表明乙醇或乙醛可升高TFR1的蛋白水平,降低Ferritin的蛋白水平,而水飞蓟宾可削弱这种改变。为了明确Ferritin在此过程中可能被降解,本实验考察了 Ferritin和溶酶体的共定位情况。实验结果显示,在乙醇或乙醛组中,Ferritin和溶酶体共定位程度显著升高,而加入水飞蓟宾后,二者共定位程度下降。同时,我们也发现,在乙醇或乙醛诱导肝细胞损伤中,LC3Ⅰ型转化为酯化形式的LC3 Ⅱ型的量明显增多,自噬底物p62蛋白水平降低。而加入水飞蓟宾后,Ferritin和溶酶体共定位程度明显下降,以上结果说明,在乙醇或乙醛诱导的铁死亡中伴随着自噬。加入自噬的抑制剂3-MA和CQ考察Ferritin和溶酶体的定位情况,结果表明,在乙醇或乙醛处理细胞的基础上,加入自噬的抑制剂可以降低Ferritin和溶酶体的共定位,说明了 Ferritin通过自噬途径被降解,释放出游离的铁离子,触发铁死亡。由于在铁死亡发生时,会引起线粒体形态和数量的变化,我们使用透射电镜观察线粒体的形态学变化。结果发现在乙醇或乙醛的作用下,异常的线粒体数目增多,而给予水飞蓟宾则线粒体数目降低。那么线粒体数目是如何被调节的呢?我们考察了线粒体自噬这一途径,通过蛋白免疫印迹法考察线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin蛋白的变化。实验结果表明,在乙醇或乙醛作用下,抽提得到线粒体样品中PINK1/Parkin的蛋白水平降低,而给予水飞蓟宾后,PINK1/Parkin的蛋白水平增加。接下来,我们在乙醇或乙醛处理的细胞中,分别敲减掉PINK1/Parkin后,发现细胞中Ferritin的蛋白水平进一步下降,并进一步导致ROS水平升高,说明线粒体自噬可抑制铁死亡。以上实验结果表明乙醇或乙醛可以诱导HepG2和HL7702细胞发生损伤,接下来我们使用SD大鼠进行造模构建体内酒精性肝病模型,考察铁死亡在这个过程中的作用。体内实验结果表明,乙醇可以诱导大鼠肝脏细胞发生自噬,促进Ferritin降解。乙醇可诱导大鼠肝脏细胞中的ROS水平和油滴累积量显著增加。而水飞蓟宾和铁死亡抑制剂均可以削弱以上实验现象,从而保护细胞。在乙醇组中,油滴积累的量较多,提示乙醇可能干扰了正常的脂质代谢,导致肝细胞发生损伤。与体外的实验结果类似,乙醇可以通过促进自噬的发生降解Ferritin,释放出游离的Fe2+,抑制抗氧化蛋白GPX4的表达同时降低线粒体自噬,而水飞蓟宾和Fer-1可以抑制Ferritin的降解、降低Fe2+水平、增加抗氧化蛋白的表达并且促进线粒体自噬的发生。我们使用分子对接的方法证明了水飞蓟宾与铁死亡相关蛋白均具有较好的结合作用。以上实验结果均表明水飞蓟宾可以对抗由乙醇诱导的铁死亡,发挥保肝作用。通过体外和体内实验,我们明确了乙醇或乙醛是通过调节线粒体和铁的代谢过程来影响肝细胞损伤的,而水飞蓟宾通过调节线粒体功能和铁的代谢来保护肝脏细胞。本研究可为临床使用水飞蓟宾治疗酒精性肝病提供数据支持,并为相关治疗药物的开发提供新的策略。