枯草杆菌漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,不但能够催化各种芳胺类、酚类等小分子物质的氧化,而且能够作用于大分子物质木质素,参与木质素的聚合和降解。作为一种有潜力的工业应用性酶,漆酶具有许多优势,如底物具有多样性、宽的pH范围、高的热稳定性等。漆酶在食品、造纸、纺织、生物合成、以及生物传感器等方面都有着广泛的应用。然而我们发现原始枯草杆菌漆酶CAR2（R155）虽然对环境的敏感性高,但活力较低。为满足漆酶在应用领域的需要,我们通过紫外线诱变得到了一株高产漆酶的二代原始菌株CAH4（H155,498LEAG501）,进一步针对漆酶的关键位点（502）,通过定点突变的方法,由原始漆酶CAR2、CAH4和对照漆酶CAH2（R155H）得到了三组漆酶:一.CAR2、RF1（M502F）、RL3（M502L）;二.CAH2、HF3（R155H、M502F）、HL5（R155H、M502L）;三.CAH4、HH5（498LEAG501、M502F）其中CAR2、CAH2（R155H）为共享的原始漆酶和对照突变体漆酶。本文通过对比性研究发现,第二组漆酶（CAH2、HF3、HL5）、第三组漆酶（CAH4、HH5）和第一组漆酶中的突变体漆酶（RF1、RL3）最适pH均由CAR2的4.0提高到4.6,最适温度也均由CAR2的50℃提高到60℃,说明第二组漆酶（CAH2、HF3、HL5）、第三组漆酶（CAH4、HH5）以及第一组漆酶中的突变体漆酶（RF1、RL3）的适应性更好,应用性更强。漆酶作为一种金属酶,不同的金属离子对酶活性的影响不同。第二组漆酶（CAH2、HF3、HL5）和第三组漆酶（CAH4、HH5）的活力和催化效率均高于第一组漆酶（CAR2、RF1、RL3）的活力和催化效率;但是第一组漆酶（CAR2、RF1、RL3）和第三组漆酶（CAH4、HH5）对环境的敏感性高于第二组漆酶（CAH2、HF3、HL5）,尤其是对Mn²⁺较敏感。其中,漆酶CAH2虽然是上述三组漆酶的催化活力和催化效率中最高的,分别比原始漆酶CAR2提高了约4倍和9倍,但CAH2对环境的敏感性也是最低的,相比较上述三组中其他漆酶受Mn²⁺影响最小;而漆酶CAH4的催化活力和催化效率分别比原始漆酶CAR2提高了约2.7倍和4.1倍,同时对环境的敏感性也明显比漆酶CAH2高,在Mn²⁺存在时,其催化效率提高的较显著,基本达到CAH2的催化效率。从应用性上看,上述八种漆酶对靛蓝胭脂红（靛蓝类）和刚果红（偶氮类）均有较好的脱色效果,脱色率高于75%;原始漆酶和突变体漆酶对活性亮蓝（蒽醌类）、甲基红（偶氮类）的脱色效果较差,其中M502F、M502L类突变体漆酶脱色效果略高于其他漆酶。漆酶对结晶紫的催化作用是非常依赖介体ABTS存在的,在有介体ABTS存在下,所有漆酶对结晶紫（三苯甲烷类）均有较好的脱色效果,除了原始漆酶CAR2外,其它漆酶的脱色率均达86%左右,而且不同漆酶之间差异很小。相比之下,在无ABTS存在下,所有漆酶对结晶紫的脱色率均低,只有10%左右。研究发现,在Mn²⁺存在下,八种漆酶的脱色率在各时间点均有明显提高,催化3小时后,脱色率均接近100%。其中突变漆酶CAH4对靛蓝脱色效力最好,作用1.5小时后达到100%。总体上来说,对于枯草杆菌漆酶,T3Cu²⁺位附近的R155位点显著影响漆酶的活性和对环境的敏感性,R155H突变明显提高漆酶的活性,但降低漆酶对环境的敏感性,而T1Cu²⁺位附近的498-501肽段主要影响漆酶对环境的敏感性。我们得到的突变体漆酶的比活力、最适温度、温度稳定性以及脱色率、对环境的敏感性等方面都得到了明显的提高,可更好地满足工业需要。通过关键位点氨基酸的改变,进一步比较漆酶结构和功能的关系,为漆酶在广泛的应用奠定基础。