论文部分内容阅读
目的：1.特异性抑制C1C-3表达对人胶质瘤U251细胞生物学特性的影响；2.抑制U251细胞C1C-3表达观察其对顺铂敏感性变化及探讨机制。方法：1.MTT法检测细胞生存率；2.构建pSH1Si-C1C-3重组质粒；3.细胞转染；4.细胞凋亡检测；5.AO染色检测细胞内酸性小泡；6.溶酶体示踪红染色；7.电镜检测细胞超微结构变化；8.MDC检测自噬泡形成；9.RT-PCR检测mRNA表达变化；10Western-blot检测蛋白表达变化；11.DCFH-DA检测细胞内ROS产生；12.数据进行统计学分析。结果：1.用特异性反义寡核苷酸有效抑制U251细胞C1C-3基因和蛋白表达(抑制率>50%),对U251细胞生物学特性影响：①抑制U251细胞增殖,诱导U251细胞发生凋亡；②降低U251细胞体外侵袭力和迁移力,抑制MMPs基因表达；③抑制内吞体-溶酶体酸化；④增加胞浆中氯离子浓度。2.抑制氯通道C1C-3表达增加人胶质瘤U251细胞对顺铂的敏感性：①顺铂对U251细胞生长抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性,U251细胞对顺铂具有相对较高耐药性；②抑制ClC-3表达能明显增加U251细胞对顺铂的敏感性；③顺铂作用于U251细胞诱导细胞发生自噬,抑制C1C-3表达能抑制顺铂诱导的U251细胞自噬；④顺铂诱导细胞凋亡具有时间依赖性,抑制C1C-3表达能明显增加顺铂诱导U251细胞凋亡,可使细胞凋亡窗口前移；⑤顺铂可诱导U251细胞Akt活化增加,抑制C1C-3表达可明显抑制顺铂诱导Akt活化。3.抑制氯通道C1C-3表达增加人胶质瘤U251细胞对顺铂敏感性机制探讨：①抑制ClC-3表达通过NADPH氧化酶依赖途径降低顺铂诱导ROS生成增多。②抑制C1C-3表达能明显抑制顺铂诱导的Nox2、Nox4 mRNA表达增加,并能降低hVps34 mRNA表达；③抑制C1C-3表达能明显抑制顺铂诱导的Akt/mTOR途径活化；NADPH氧化酶抑制剂DPI可抑制顺铂诱导的Akt/mTOR途径活化；用3-MA抑制hVps34,对顺铂诱导的Akt/mTOR途径活化无明显影响；④顺铂可同时诱导U251细胞发生凋亡和自噬,应用自噬抑制剂3-MA能明显增加顺铂诱导细胞凋亡；DPI抑制NADPH氧化酶活性,可增强顺铂诱导细胞自噬,但由于其抑制Akt/mTOR途径活化,故也增加顺铂诱导细胞凋亡；抑制ClC-3表达可抑制顺铂诱导自噬发生,增加凋亡。结论：1.特异性反义寡核苷酸可有效抑制U251细胞C1C-3 mRNA和蛋白表达,抑制C1C-3表达可影响内吞体和溶酶体酸化,改变细胞内氯离子浓度；抑制U251细胞生长,诱导U251细胞发生凋亡,但程度不高,即难以依靠单独抑制C1C-3基因表达的作用达到肿瘤治疗的目的；降低MMPs基因表达,抑制U251细胞体外侵袭力和迁移力。2.构建pSH1Si-C1C-3表达质粒能显著抑制U251细胞C1C-3 mRNA和蛋白表达(抑制率＞80%)；抑制ClC-3表达能明显增加U251细胞对顺铂的敏感性,原因包括：顺铂可诱导U251细胞发生自噬和凋亡,抑制ClC-3表达通过抑制自噬增加顺铂诱导的细胞凋亡；Akt激活需要ClC-3,抑制ClC-3表达可明显抑制顺铂诱导Akt活化。3.抑制ClC-3表达影响由NADPH氧化酶介导的顺铂诱导U251细胞ROS产生,从而抑制顺铂诱导Akt/mTOR途径活化；抑制ClC-3表达影响细胞自噬主要通过影响内吞体-溶酶体酸化和Beclinl/Vps34途径。