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阿尔巴斯白绒山羊是内蒙古自治区优良家畜品种,属绒肉兼优型珍稀品种,其绒毛被视为“软黄金”,肉被视为“肉中人参”,在我国畜牧业生产中占有十分重要的地位。利用现代生物技术建立阿尔巴斯白绒山羊多能干细胞系不仅可以为相关学科的发展提供理论依据,同时在其遗传育种方面也具有十分重要的应用价值。虽然目前对家畜干细胞的研究不断深入,但其胚胎干细胞的建系一直未能成功。近年来随着诱导性多潜能干细胞技术的兴起,利用特定因子诱导成体细胞重编程成多潜能干细胞已成为可能。本研究将特定转录因子导入阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞,获得阿尔巴斯白绒山羊诱导性多潜能性干细胞(giPSCs)。对giPSCs表达胚胎干细胞标记蛋白、细胞核型、体外三胚层分化的类胚体以及体内畸胎瘤形成能力进行观察,并对giPSCs进行全基因表达谱芯片分析,进一步了解其重编程情况,探索研究其分子机制,为绒山羊胚胎干细胞的建系提供实验依据。1 giPSCs的建系1.1 giPSCs的生成利用强力霉素(Dox)诱导性慢病毒载体,将特定干细胞多能性转录因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)转入阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)使细胞重编程,约20d后可见小鼠胚胎干细胞样克隆生成,即giPSCs。giPSCs呈立体状生长,椭圆形、表面光滑、折光性强。第28d,经碱性磷酸酶(AP)染色鉴定,约80%的克隆呈阳性。1.2 giPSCs的多能性检测免疫荧光检测结果显示giPSCs表达OCT4.SOX2.NANOG.SSEA-1. TRA-1-60和TRA-1-81等胚胎干细胞标志性蛋白,而不表达SSEA.3和SSEA-4。RT-PCR结果显示giPSCs表达OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、 REX1等胚胎干细胞标记基因。giPSCs能在体外自分化形成具有三胚层分化的类胚体,经免疫荧光检测具有外胚层标记蛋白Ⅲβ-Tubulin、中胚层标记蛋白Desmin和内胚层标记蛋白Cytokeratin的表达；giPS Cs能在体内分化形成畸胎瘤,经组织切片染色检测具有腺体样组织(内胚层)、肌肉组织(中胚层)和神经组织(外胚层)的分化。giSCs具有正常核型,为58+XX。2giPSCs诱导及培养条件的优化2.1转录因子的搭配和培养基的优化转录因子组合OSMK(将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc组合至一个载体中)、Oct4+Sox2+Klf4+c-Myc和Oct4+Sox2+Klf4都能诱导GFFs生成giPSCs。其中OSMK病毒感染的细胞,每5×104个细胞中可获得22.8+2.9个AP阳性克隆,克隆重编程成度高,不易分化,内源基因OCT4和NANOG高表达(P<0.01)；Oct4+Sox2+Klf4+c-Myc病毒组感染的细胞,每5×104个细胞中可得23.8±2.2个AP阳性克隆,长期传代后高代克隆易分化,克隆中内源的Sox2基因高表达(P<0.01)；Oct+Sox2+Klf4病毒组感染的细胞,每5×104个细胞中只获得5.0±1.0个AP阳性克隆,克隆中内源基因OCT4、SOx2和NANO G的表达水平低(P<0.01),克隆易分化。培养基中逐步添加小分子化合物Vc、VPA和LiCl,统计每5×104个细胞中生成的giPSCs的AP阳性克隆数发现,含有Vc的培养基中可形成平均17.5±1.3个阳性克隆,与未添加小分子的培养基相比干细胞标记基因OCT4、SOX2和NANOG的表达水平显著提高(P<0.01)；含有VPA+LiCl的培养基中可形成平均24.8±2.1个阳性克隆,OCT4和NANOG基因的表达水平显著提高(P<0.01)；含有Vc+VPA+LiCl的培养基中可形成平均28.9±0.75个阳性克隆,与前两组相比干细胞标记基因OCT4、SOX2、 NANOG的表达水平再次提高。结果表明培养基中添加小分子化合物Vc、VPA和LiC1能有效提高重编程效率。2.2饲养层和靶细胞的选择实验中分别选择了昆明白小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、绒山羊胎儿成纤维细胞(GFF)、山羊胎儿成纤维细胞和小鼠胎儿成纤维细匏1：1混合(MEF+GFF)细胞作为giPSCs的饲养层细胞。结果发现,giPSCs在MEF饲养层上的生长增殖速度比较慢,细胞暗淡,折光性差,易分化,内源基因OCT4、SOX2、NANOG的表达水平较低(P<0.05)。相比于MEF饲养层,GFF饲养层上培养的giPSCs克隆质量优,克隆光滑圆润,边缘清晰,细胞生长速度较快。内源基因OCT4、SOX2、NANOG的表达水平高(P<0.05)。MEF+GFF饲养层上的细胞克隆与小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养的细胞克隆相似。结果表明同源的GFF饲养层更适合giPSCs的增殖生长。靶细胞的选择上,本实验诱导阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)、肺间充质干细胞(LMSCs)、骨髓间充干细胞(BMSCs)、初级毛乳头细胞(PHFDPCs)、次级毛乳头细胞(SHFDPCs)以及成体成纤维细胞(GEFs)均能获得giPSCs o其中GFFs的重编程效率最高,每5×104个细胞中可形成24.7±2.1个AP阳性克隆；其次是PHFDPCs,每5×104个细胞中可形成20.8±1.7个AP阳性克隆,而相同条件下SHFDPCs中仅生成15.3±1.5个；两种间充质干细胞的重编程效率低于GFFss和PHFDPCs,LMSCs每5×104个细胞中可形成17.4±1.2个AP阳性克隆,BMSCs的为18.7±2.2个；成体成纤维细胞的重编程效率较低,每5×104个细胞中只形成10.4±1.8个AP阳性克隆。证明PHFDPCs和GFFs比较适合giPSCs的重编程。3 giPSCs的全基因表达谱分析3.1 giPSCs的表达差异基因的分析全基因表达谱芯片分析giPSCs (GFF-giPSCs)、GFFs和阿尔巴斯白绒山羊类胚胎干细胞(ESCLCs)中差异基因的表达情况发现,giPSCs与GFFs的表达谱有明显的差异,与ESCLCs的表达谱也有明显差异。giPSCs已进入重编程,但与ESCLCs有一定差距。giPSCs中干细胞多能性相关基因已开始表达,但表达量相比于ESCLCs的较低,多能性较弱。本实验挑选了OCT4、 SOX2、NANOG、DNMT3b、KLF5、PODXL、REX-1等20个多能性相关基因,并对比了这些基因在3组不同细胞中的表达情况。结果显示,giPSCs中多能性基因已开始表达或基因表达量明显上调,成纤维标志性基因明显下调,但giPSCs中各基因的表达量低于ESCLCs中的表达。giPSCs已有多潜能特性,但相较于ESCLCs其多能性差,自我更新能力较弱。3.2 giPSCs的多能性和增殖相关信号通路的分析对所得芯片数据进行干细胞多能性和增殖相关信号通路的KEGG数据库富集性分析结果显示,在Wnt、MAPK、PI3K-AKT、细胞周期和DNA复制等信号通路上,giPSCs的基因表达与GFFs的基因表达有显著差异,与ESCLCs的基因表达相似。giPSCs中MAPK和PI3K-AKT信号通路具有高活性,促进了giPSCs的多能性和自我更新。giPSCs中Wnt信号通路上的GSK3B虽高度聚集,但β-catenin的聚集仍然开启了TCF/LEF核心转录途径,促进了giPSCs的自我更新。在细胞周期信号通路和DNA复制信号通路上,giPSCs中除了CDK2、CYCA、CYCD、MCM2基因上调表达之外,MCM3、 MCM4、MCM6、MCM7、CDC20、CDK1的表达与GFFs相同,而M CM5的表达下调,表明giPS C中DNA复制活性低下,增殖速度缓慢。