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猪产肉量的高低和肉品质的优劣主要取决于肌纤维的数量和横截面积大小。骨骼肌的生长发育是个很复杂的生物学过程,受到多种因素的调控,研究表明microRNAs(miRNAs)对其发挥着重要的调控作用。本研究方向在前期研究中发现miR-204-5p在胚胎期猪的肌肉中高表达,却在成年个体的肌肉中几乎不表达,但其在肌肉发育中的具体功能未见报道。本试验选用小鼠骨骼肌细胞系C2C12作为研究对象,人工合成miR-204-5p的mimics和inhibitors,利用riboFECTTM CP作为转染试剂,对C2C12细胞分别转染200 nM 的 mimics(Mimics 组,MI 组)和 inhibitors(Inhibitors 组,IN 组),通过免疫荧光染色技术对成肌分化后期标志蛋白-肌球蛋白重链Myh1进行免疫荧光染色,比较分析了未转染仅诱导分化(诱导分化组,ID组)、MI组和IN组三种不同处理对C2C12细胞分化过程中肌管形成的影响;利用RNA-seq技术对ID组、MI组和IN组三组细胞进行了转录组双末端测序,对所获结果进行相关生物信息学分析,并通过差异表达转录本分析、靶标预测、qPCR验证等技术筛选确定miR-204-5p的作用靶标基因。免疫荧光染色结果发现ID组和IN组的Myh1蛋白表达量明显高于MI组;IN组的肌管长度比ID更长,肌管排列更有规则,表明miR-204-5p能显著抑制C2C12细胞分化进程中形成肌管的速度、数量与大小。ID组、MI组和IN组通过RNA-seq分别获得17914942对、19460498对和20928644对原始reads,经质量控制处理后分别获得17503791对、18986284对和20444580对clean reads。采用STAR(v2.5.2a)软件对所获clean reads和小鼠参考基因组(GRCm38.85)进行比对,结果显示:能对应到基因组上唯一位点的序列,ID组有15737764对(占90.87%)、MI 组 17197729 对(占 90.58%)以及 IN 组 18616465 对(占 91.06%)。采用TMM方法对原始读段计数进行校正后,利用DEseq软件包鉴定差异表达基因(FDR<0.5),结果发现:ID组与MI组中共有78个转录本差异表达,其中34个转录本在ID中高表达,44个转录本在MI中高表达;ID组与IN组中共有101个转录本差异表达,其中34个转录本在ID中高表达,67个转录本在IN中高表达;MI组与IN组中共有39个转录本差异表达,其中13个转录本在MI中高表达,26个转录本在IN中高表达。通过对各差异表达转录本的比较分析并结合测序所获各转录本对应的CPM值,共筛选出miR-204-5p的潜在作用靶标13个,分别是Lrp4,C1qtnf3,Myh3,Olfml2b,Pdlim3,My14,Myh1,Myh4,Sema3c,Actc1,Aspn,Ogn 和 Mef2c,利用 miRNAs 的在线预测软件并结合QPCR定量结果,最终筛选出Lrp4,Mef2c,Pdlim3,C1qtnf3,Sema3c和Ogn6这6个基因作为miR-204-5p的作用靶标基因,miR-204-5p通过抑制它们的表达从而抑制肌管的形成速度,影响C2C12细胞的成肌分化进程。