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烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)是一种配体型门控离子通道,呈五聚体结构,与配体结合部位集中在受体胞外N端区域。nAChRs按照组织分布可分为:神经型nAChRs和肌肉型nAChRs。按照亚基组成可分为:同型的五聚体nAChRs(α7)和异型的五聚体nAChRs(α3β2、α3β4、α4β2等)。神经型nAChRs与抑郁症、烟碱成瘾、阿尔茨海默症等神经生理病理过程相关,也是许多相关药物作用的重要靶点。α3β2和α3β4是两种重要的nAChR亚型,主要分布在中枢和外周神经系统,两者具有不同的神经病理和生理功能,其中α3β2 nAChR主要与疼痛相关,而α3β4 nAChR主要与烟碱成瘾、药物滥用、肺癌等生理和病理过程相关,β2与β4亚基是导致两种亚型在功能和结构上呈现差异的重要原因之一。β2与β4两种亚基的氨基酸序列具有较高的同源性,其胞外N端的Loop D、E、F是配体结合的主要区域。确定β2亚基配体结合区域的关键氨基酸位点,对于研究受体功能差异,筛选亚型特异性药物以及研究药物作用机理的分子机制都具有重要意义。本研究通过PCR介导的定点突变技术,对β2亚基上配体结合的三个关键区域Loop D、E、F中的关键氨基酸(12个位点)进行定点突变,将β2亚基上12个位点的氨基酸替换为β4亚基对应位点的氨基酸,构建12种突变体。同时利用nAChR特异的激动剂乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)和拮抗剂α-芋螺毒素(α-Conotoxin,α-CTx)RegILA和LvIA,通过双电极电压钳技术,对突变体的活性以及配体和受体结合的分子机制进行研究。结果表明:β2亚基Loop D中的第59位的苏氨酸(Thr,T)对应突变为赖氨酸(Lys,K),虽然激动剂ACh对α3β2[T59K]突变体的活性没有改变,但是拮抗剂α-CTx RegIIA对α3β2[T59K]活性却显著增强,半阻断剂量(IC50)从本体的35 nM减小至3.1 nM,活性增强了11倍。拮抗剂α-CTx LvIA对α3β2[T59K]活性也显著增强,半阻断剂量(IC50)从本体的16 nM减小至3.2 nM,活性增强了 5倍。β2亚基Loop E中的第106位的苯丙氨酸(Phe,F)对应突变为缬氨酸(Val,V),第108位的丝氨酸(Ser,S)对应突变为苏氨酸(Thr,T),第111位的缬氨酸(Val,V)对应突变为异亮氨酸(Ile,I),第1 13位的丝氨酸(Ser,S)对应突变为精氨酸(Arg,R)。突变后,激动剂ACh对α3β2[F106V]突变体的活性有所增强,半数有效浓度(EC50)由43μM变为22 μM,活性提高了 2倍。拮抗剂α-CTx RegIIA对α3β2[F106V]、α3β2[S108T]和 α3β2[VlllI]nAChR 的活性降低,IC50从本体的 35 nM分别增加至360 nM、440 nM、870 nM,活性分别降低了 10倍、13倍、25倍,但是对α3β2[S113R]的活性增强,IC50从本体的35 nM减小至3.2 nM,活性增强了 11倍。拮抗剂 α-CTx LvIA 对 α3β2[F106V]、α3β2[S108T]和 α3β2[V111I]nAChR 的活性降低,IC50从本体的16 nM分别增加至400 nM、1400 nM、340 nM,活性分别降低了 25倍、88倍、21倍,但是对α3β2[S113R]的活性增强,IC50从本体的16 nM减小至4.1 nM,活性增强了 4倍。当β2亚基Loop F中的第168位的丝氨酸(Ser,S)对应突变为异亮氨酸(lle,I),激动剂ACh对α3β2[S1681]突变体的活性有所增强,EC50由43 μM变为26μM,活性提高了 1.6倍。拮抗剂α-CTx RegIIA对α3β2[S1681]nAChR的活性升高,IC50从本体的35 nM降低至1.0 nM,活性升高35倍。拮抗剂α-CTx LvIA对α3β2[S168I]nAChR的活性升高,IC50从本体的16 nM降低至0.7 nM,活性升高了 23倍。本研究利用PCR介导的受体定点突变技术,对β2亚基三个配体结合区的关键氨基酸进行了点突变,不仅优化了定点突变的方法,还建立了 α3β2 nAChR的12种突变体模型,确定了 β2亚基上106、108、113、168位4个新的关键氨基酸位点。本研究对研究nAChR亚基上的关键氨基酸位点进行了新的探索,建立的受体突变体模型也为研究配体和相关药物与α3β2 nAChR相互作用的分子机制提供了基础。