Ophiostoma piceae胆固醇酯酶（EC 3.1.1.13）能高效催化胆固醇酯的水解;或在非水相条件下的胆固醇的酯化反应。O.piceae胆固醇酯酶在食品加工、制药（核苷类或固醇类激素的合成）、纸浆树脂障碍的控制等领域具有重要的应用价值。胆固醇酯的可溶性差,底物浓度低,严重降低了酶的催化效率。高温有助于增大胆固醇酯的可溶性,提高反应体系中底物的浓度,进而提高反应速率。O.piceae胆固醇酯为中温酶,热稳定性欠佳。本论文采用生物信息学手段,构建、评估并筛选了O.piceae胆固醇酯酶热稳定性突变体电子文库;对电子文库中存在盐桥效应、脯氨酸效应和突变位点位于β-转角的突变体,分别进行了实验验证;纯化并测定了阳性突变体催化水解反应的动力学参数。具体实验结果如下:1、分别测定了Bacillus subtilis脂肪酶A（缩写为:BSA）、Burkholderia sp.脂肪酶（缩写为:BCL）和O.piceae胆固醇酯酶（缩写为:OPE）的基本酶学性质及三种酯解酶水解可降解聚酯高分子材料（以聚ε-已内酯和聚醋酸乙烯酯为模型底物）的活性。纯化后的BSA、BCL和OPE相对分子量分别为:24 k Da,34 k Da和76 k Da。BSA、BCL和OPE催化水解反应的最适温度分别为40℃,40℃和35℃;最适p H分别为8.0,8.0和7.5。三种酯解酶均对中链脂肪酸酯（C8-C10）表现出偏爱性。BSA和BCL水解聚ε-己内酯的初始速率分别为57和80μg min-1U-1;OPE水解聚醋酸乙烯酯的初始降解速率为4.4×10-3μmol min-1U-1。2、利用生物信息学手段,构建、评估并筛选了OPE热稳定性突变体电子文库;并基于可能存在的突变效应,对电子文库中的突变体进行了分类。运用Fold X、Rosetta和Po PMu Si C软件,经逐一评估并筛选后,构建出一个包含1675个热稳定性突变体的电子文库;突变体电子文库的筛选标准及流程具体如下:（1）排除催化三联体发生突变的突变体;（2）突变后导致蛋白结构不稳定的突变体,包括:突变后导致蛋白质空间结构冲突、突变后的芳香族氨基酸和甲硫氨酸残基暴露到蛋白质分子表面、突变导致蛋白质的氢键和盐桥作用力减少,但又没有替补作用力、α-螺旋被破坏等;（3）突变位点位于β-转角的突变体进一步筛选流程为:（1）对OPE蛋白所有的β-转角进行柔性分析并排序;突变位点位于柔性分析排名前五的β-转角才进入进一步筛选;（2）统计分析热稳定蛋白的β-转角类型及各个类型的氨基酸组成偏好性;（3）突变后的氨基酸符合上述热稳定蛋白β-转角组成氨基酸偏好性统计规律;（4）存在脯氨酸效应的突变体进一步筛选流程为:（1）突变后脯氨酸,所在位置的二面角应在下列范围（φ=-90 to-40°,ψ=120 to180°或ψ=-50 to 10°）;（2）相对溶剂可接触表面积RSA>50%;（3）Δz＿RMSF（370K-300K）>0;（5）存在盐桥效应的突变体进一步筛选流程如下:（1）形成盐桥的氨基酸残基在一级结构上的间隔距离≥5;（2）形成盐桥的两个氨基酸残基,至少其中一个氨基酸残基的相对溶剂可接触表面积大于50%。OPE热稳定性突变体电子文库中,存在上述三种效应的突变体,经过上述筛选流程,最终筛选出25个候选突变体,其中6个突变体位于β-转角位置、9个突变体存在盐桥效应、10个突变体存在脯氨酸效应。上述25个候选热稳定突变体,将被进行后续实验验证。3、利用定点突变技术,构建、表达、纯化并实验评估上述25个候选热稳定OPE突变体。利用定点突变技术构建并测序验证上述候选突变基因;突变基因经毕赤酵母异源表达、亲和层析色谱柱纯化后,获得电泳纯突变体重组蛋白;分别测定突变体重组蛋白的T50及半衰期t1/2,并与野生型OPE进行比较。实验结果表明:突变位点位于β-转角的热稳定突变体,叠加突变体OPE-S109P/S271P热稳定性显著,T5030提高了8.9℃,半衰期t1/2是野生型OPE的3.6倍;存在盐桥效应的热稳定性突变体OPE-A231E,T5030提高了11.8℃,半衰期t1/2是野生型OPE的6.4倍。双突变体OPE-T383E/A355E的T5030提高了16.7℃,半衰期t1/2是野生型OPE的10.5倍。存在脯氨酸效应的叠加突变体OPE-D136P/V252P,T5030提高了11.6℃,半衰期t1/2是野生型OPE的4.5倍。