论文部分内容阅读
背景与目的：β地中海贫血是一组由于β珠蛋白基因突变从而导致β珠蛋白肽链合成减少(β+)或缺乏(β0)为特征的常染色体遗传性血液病。在世界范围内发现160余种突变，其中中国有21种。据全国血红蛋白协作组调查，β地中海贫血携带率为0.67%，个别地区如云南、香港达到6%。巢式PCR结合核酸限制性片段长度多态性、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳及DNA测序已成功地应用于β地中海贫血的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)。PGD及富集孕妇外周血胎儿细胞的无创性产前诊断一般只取一或几个细胞，DNA模板量非常有限。巢式PCR技术的灵敏度已达到单细胞水平，但是该技术的一个局限之处是难以检测单细胞多个基因或一个基因的多个分散的位点。若引物延伸预扩增(primer extension preamplification, PEP)及反向斑点杂交(reverse dot blot, RDB)技术能应用于PGD及无创性产前诊断，那么可使诊断的基因突变位点明显增加，而且操作相对简便，目前尚未见研究报道。细胞的裂解是影响单细胞PCR扩增效率的重要因素。本实验首先探讨细胞裂解法对单细胞PCR扩增效率的影响，寻求较好的细胞裂解法，为后续试验奠定基础，然后探讨单个细胞水平同时检测β地中海贫血多个突变技术，同时为单个细胞水平运用DNA阵列技术检测多个基因突变位点的可行性提供实验依据。方法：实验分为2个部分：1. 应用显微分离技术分离单个淋巴细胞，分别使用冻融变性和Rechitsky等的蛋白酶K裂解法处理单细胞，应用多重PCR同时扩增X染色体特异重复序列(DXZ1)和Y染色体特异重复序列(DYZ1)对单细胞进行性别诊断，比较其扩增效率，寻求较好的细胞裂解方法。2. 将我国β地中海贫血常见8种突变点(CD41-42、IVS-Ⅱ-654、CD17、TATA box nt -28、CD71-72、TATA box nt -29、CD26、IVS-Ⅰ-5)的等位特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleiotide,ASO)探针点样于尼龙膜上，制备β地中海贫血常见突变诊断膜条。应用较好的细胞裂解法处理单个细胞，采用15个碱基的随机引物对单个细胞的基因组进行PEP，取其产物5μl分别对β地中海贫血的目的基因片段进行巢式或半巢式PCR扩增与生物素标记，然后采用β地中海贫血常见突变诊断膜条与标记产物进行RDB检测β地中海贫血突变型。结果：<WP=7>1. 使用显微操作法获得80个男性淋巴细胞。采用冻融变性处理单细胞，40个淋巴细胞经多重PCR扩增后有32个产生DXZ1和DYZ1两条电泳带，正确率为80%。采用蛋白酶K裂解法，40个淋巴细胞经多重PCR扩增后均产生DXZ1和DYZ1两条电泳带，正确率为100%。因而提示Rechitsky等的蛋白酶K裂解法的扩增效率明显高于冻融变性(χ2=6.81,P<0.01)。2. 使用显微操作法分别从1例正常女性及4例β地中海贫血血标本中获得3个淋巴细胞。采用Rechitsky等的蛋白酶K裂解法处理单个淋巴细胞，扩增效率为93.3%，等位基因脱扣率为6.7%。RDB杂交后结果显示与预料的相符，其基因型依次为N/N、CD17(A→T)/N、IVS-Ⅱ-654(C→T)/CD17(A→T)、CD41-42(-CTTT)/N、TATA box nt -28(A→G)/N。结论：1．Rechitsky等的蛋白酶K裂解法比较简便，费时短，扩增效率高，适合细胞裂解及PCR扩增模板的制备；2．采用多重PCR同时扩增X染色体和Y染色体特异重复序列，是一种简便、可靠的性别诊断方法，对于性连锁隐性遗传病的产前干预有重要的意义；3．在单细胞水平应用PEP及RDB技术可以同时检测β地中海贫血多个突变，操作相对简便，为胚胎植入前遗传学诊断和无创性产前诊断的应用提供了新的检测方法，有较好的临床应用前景；4．本实验为在单细胞水平运用DNA阵列技术检测一种或多种遗传病的多个基因突变位点的可行性提供了实验依据，而且该技术在PGD和无创性产前诊断领域可能将有较好的实用价值。