白血病是血液系统常见的恶性疾病，对初诊白血病的患者尽可能做出精确的预后判断，制定出个体化治疗方案，是提高CR率、延长生存期的关键。一些基因的过度表达被认为是预后不良相关因素，而由于检测这些基因及其表达产物的复杂性，限制了在广大基层医院应用。建立低成本的ELISA、免疫组化法检测基因的蛋白水平的表达，可适用于基层医院，其中的关键是需要特异性抗体特别是单克隆抗体。因此，制备低成本、高敏感性的抗体是该方法能在临床中广泛应用的前提。 目的： 本实验旨在通过基因工程的方法获得高纯度的FLT3、P170抗原，验证其抗原性，并制备多克隆抗体，为进一步制备单克隆抗体及建立免疫组化及ELISA方法检测蛋白表达水平奠定基础。 方法： 从P170、FLT3表达阳性患者的骨髓单个核细胞中提取mRNA，并逆转录成cDNA，以此为模板进行PCR，扩增出P170、FLT3的基因片段，再将这段基因片段与载体pCR T7/NT—TOPO连接，构建重组克隆质粒。经PCR和DNA序列分析鉴定后，用鉴定基因重组正确的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG小量诱导，诱导产物用SDS—PAGE电泳进行分析。选择可产生目的蛋白的克隆，转接至500mL的LB培养基扩增培养，IPTG诱导。超声破碎菌体，分离包涵体和上清，SDS—PAGE证实目的蛋白主要存在于包涵体中。洗涤包涵体，尿素裂解，通过Ni离子亲和层析对目的蛋白进行纯化。并通过Western blot的方法对其进行鉴定。以纯化的重组蛋白片段作为抗原，制备多克隆抗血清。 结果： 1、对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见条带与预期扩增的P170、FLT3的长度。 2、对重组克隆质粒进行PCR验证，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，与预期连接的基因片段相符。DNA序列分析结果与P170、FLT3基因片段的相应序列一致，表明目的基因已被正确克隆。 3、重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，对IPTG小量诱导产物进行SDS—PAGE电泳分析，与空白对照未诱导的大肠杆菌BL21(DE3)相比较在预期分子量处可发现有一个明显的蛋白条带。表明重组表达质粒可以正确表达目的蛋白。对超声破碎后离心所得的包涵体和上清进行SDS—PAGE电泳分析，证实目的蛋白主要存在于包涵体中。 4、Western blot证实重组蛋白可特异性地与抗6-His单抗发生免疫反应。表明所获得的目的蛋白为所需融合蛋白。 5、以纯化后的目的蛋白作为抗原，免疫动物，可制备多克隆抗体，表明该重组蛋白有较好的抗原性。 结论： 1、成功构建了重组质粒P170、FLT3-pCR T7/NT—TOPO。 2、重组质粒可高效表达目的蛋白。 3、纯化得到高纯度的目的蛋白。 4、目的蛋白抗原性良好，可制备抗P170、FLT3多克隆抗体。