沙门氏菌(Salmonella)和单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是两种常见的重要食源性致病菌,对人类健康和食品安全危害严重。建立这两种致病菌的快速检测方法,对控制食品污染和食源性疾病的发生、疾病暴发后的溯源、预防控制措施的测评等等都具有重要意义。PCR是目前比较成熟的快速检测技术之一,但国内外采用增菌-PCR检测食品中致病菌的报道较少。荧光定量PCR (RT-PCR)是近年来较新的检测技术,它的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实现对整个PCR进程的监测,并能对起始模板进行定量分析,具有敏感、特异、快速、高效的优点。该技术应用于致病菌检测方面的研究国外开展较早,国内相关报道较少。本研究分别以沙门氏菌、单增李斯特氏菌特异性产毒基因序列为基础,选择特异的引物对和探针,采用本实验室保存的标准菌株和分离菌株等参考菌株,优化反应条件,建立食品中沙门氏菌和单增李斯特氏菌PCR和RT-PCR检测方法。通过人工染菌实验,评价增菌-PCR和RT-PCR检测方法的特异性和敏感性,并与传统方法进行比较。检测市售食物样本,评价增菌-PCR、RT-PCR的应用价值。在两种菌单一RT-PCR基础上,建立沙门氏菌和单增李斯特氏菌的二重RT-PCR方法。一、食品中沙门氏菌快速检测技术的研究1.沙门氏菌增菌-PCR检测技术的研究根据invA基因序列选择特异的引物,建立沙门氏菌PCR检测方法。采用共计48株参考菌株验证方法的特异性,30株沙门氏菌扩增结果均为阳性,18株非沙门氏菌扩增结果均为阴性,结果表明建立的PCR方法稳定、特异性好。选用肠炎沙门氏菌CMCC50041进行染菌实验,染菌量分别为每25g样本1、10、102、103、104、105和106 CFU,分别在增菌0h、4h、8h、12h和18h取1ml培养液,提取DNA进行PCR检测,并同时划线接种选择性平板,用传统方法进行分离鉴定,比较两种方法检测的敏感性和特异性。人工染菌样本在增菌12h后,PCR法检出限可达1CFU/25样本,传统方法检出限为10 CFU/25g。增菌-PCR方法检出时限至少比传统方法提前4天,较传统的分离方法更加快速、敏感度更高。采用该方法检测16份禽肉样本,结果为7份阳性,阳性率为43.75%,与传统方法检测结果一致。增菌-PCR适用于禽肉中沙门氏菌的快速定性检测。2.沙门氏菌荧光定量PCR检测技术的研究根据invA基因序列选择特异的引物和探针,建立沙门氏菌RT-PCR检测方法。采用共计48株参考菌株验证方法的特异性,30株沙门氏菌检测结果均为阳性,18株非沙门氏菌检测结果均为阴性,结果表明建立的RT-PCR方法稳定、特异性好。采用不同浓度的肠炎沙门菌悬液测定该方法的敏感性,结果RT-PCR对菌液的最低检出限为5.2×103CFU/ml,在5.2×103～5.2×1010CFU/ml范围内,菌浓度的对数值和检测结果的Ct值线性关系良好。选用肠炎沙门氏菌CMCC50041进行染菌实验,染菌量分别为每25g样本1、10、102、103、104、105和106CFU,分别在增菌Oh、4h、8h、12h和18h取1ml培养液,提取DNA进行RT-PCR检测,并同时与增菌-PCR和传统方法检测结果比较。人工染菌样本在增菌8h内,RT-PCR的敏感性比PCR高10--100倍；在增菌12h后,RT-PCR法和增菌-PCR的检出限都可达1CFU/25g,比传统方法敏感10倍。根据增菌12h的检测结果,建立了RT-PCR样本标准曲线Conc= 10^(-0.305×Ct12h+10.870), R12h2=0.995, e12h=1.02,定量结果Var≤20%。,采用RT-PCR检测16份禽肉样本,检出7份阳性,阳性率为43.75%,与增菌-PCR和传统检测结果一致。根据所得的样本标准曲线,RT-PCR方法可对检测样本进行定量分析,确定阳性样本中初始含量菌。所建立的沙门氏菌RT-PCR适用于禽肉中沙门氏菌的快速定量检测,整个操作可在15h内完成。二、食品中单增李斯特氏菌快速检测技术的研究1.单增李斯特氏菌增菌-PCR检测技术的研究根据hlyA基因选择特异的引物,建立单增李斯特氏菌PCR检测方法。采用共计46株参考菌株验证方法的特异性,26株单增李斯特氏菌扩增结果均为阳性,20株非单增李斯特氏菌扩增结果均为阴性,结果表明建立的PCR方法稳定、特异性好。选用单增李斯特氏菌CMCC54004进行染菌实验,染菌量分别为每25g样本1.3、1.3×10’、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU,分别在LB增菌Oh、4h、8h、12h、 18h、24h、30h、36h和46h取1ml培养液,提取DNA进行PCR检测。不增菌,所有染菌量下都检不出阳性结果；增菌4、8h和12h后,RT-PCR的检测限分别为1.3×105、1.3×104、和1.3×103CFU/25g,增菌18h-24h,检测限都为1.3×l02CFU/25g。二步增菌后,检测限进一步提高,增菌36h,检测限为1.3×102CFU/25g,增菌46h,检测限达到1.3CFU/25g,与传统方法检出限一致。但增菌-PCR较传统更加快速,检出时限至少比传统方法提前4天。采用该方法检测24份猪肉样本,结果为17份阳性,阳性率为70.83%,与传统检测结果一致。2.单增李斯特氏菌荧光定量PCR检测技术的研究根据hlyA基因选择特异的引物,建立单增李斯特氏菌RT-PCR检测方法。采用共计46株参考菌株验证方法的特异性,26株单增李斯特氏菌扩增结果均为阳性,20株非单增李斯特氏菌扩增结果均为阴性,结果表明建立的RT-PCR方法稳定、特异性好。采用不同浓度的单增李斯特氏菌悬液测定RT-PCR方法的敏感性,该方法对菌液的最低检出限为1.3×103CFU/ml,在1.3×103～1.3×109CFU/ml范围内,菌浓度的对数值和检测结果的Ct值线性关系良好。选用单增李斯特氏菌CMCC54004进行染菌实验,染菌量分别为每25g样本1.3、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3x105和1.3×106CFU,分别在LB增菌Oh、4h、8h、12h、18h、24h、30h、36h和46h取1ml培养液,提取DNA进行RT-PCR检测,同时进行PCR检测并在增菌46h进行划线分离,用传统方法检测,比较三种方法检测的敏感性和特异性。结果表明,一步增菌24h,采用RT-PCR检测,检出限可达1.3 CFU/25g;采用增菌-PCR检测,检出限达1.3×102 CFU/25g。增菌-PCR及传统方法检出限若达到1.3 CFU/25g,则需要进行二步增菌约46h。根据增菌24小时的检测结果,建立了RT-PCR样本标准曲线Conc= 10^(-0.298×Ct24h+11.606),其中R24th2=0.998,e24h=0.99定量结果Var≤15.58%。采用RT-PCR检测24份市售猪肉样本,结果为17份阳性,阳性率为70.83%,与增菌-PCR和传统方法检测结果一致。根据所得的样本标准曲线,RT-PCR方法可对检测样本进行定量分析,确定阳性样本中初始含量菌。所建立的RT-PCR适用于猪肉中单增李斯特氏菌的快速定性及定量检测,整个操作可在27h内完成。三、沙门氏菌和单增李斯特氏菌二重RT-PCR检测方法的建立在两种菌单一RT-PCR方法的基础上,建立二重RT-PCR。用14株参考菌株评价该方法的特异性。6株沙门氏菌和6株单增李斯特氏菌,均出现特异荧光信号,两种细菌的检测互不干扰,无交叉反应；2株非目的菌株没有产生荧光信号,证明所建立的二重RT-PCR法稳定。如果想将该方法应用于食物样本检测,下一步的研究重点是筛选出适宜的增菌液以实现同步前增菌。本研究所建立的快速检测技术可为食源性疾病诊断、溯源和危险性评估积累科学数据,为食品中这两种致病菌的快速检测及食物中毒的快速诊断提供技术支持。为国家食品安全监管部门制定决策提供有力的技术保障,也为后续食品安全国家标准制修订中快速检测方法的建立奠定基础。