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背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是全世界癌症相关死亡的主要原因。肺癌主要分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌两大病理类型,其中NSCLC约占全部确诊肺癌的85%。尽管在手术、放疗、化疗和靶向治疗等方面取得了不错的进展,但NSCLC的预后仍然很差,5年生存率低于20%。近年来,肺癌免疫治疗取得了重大突破,以靶向程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1,PD-1）及其配体PD-L1的单克隆抗体为代表的免疫检查点阻断疗法已经产生了显著的临床反应,并彻底改变了肺癌治疗的格局。然而,由于原始或获得性耐药和不良反应,只有一小部分NSCLC患者可以从免疫相关治疗中受益。肿瘤组织PD-L1表达水平是首个被FDA批准用于预测抗PD-1/PD-L1免疫治疗反应的生物标志物。多项临床试验证明,在接受PD-1/PD-L1阻断治疗的NSCLC患者中,PD-L1高表达的患者显示出更长的生存获益。此外,一些旨在替代或补充PD-L1的预测性生物标志物如肿瘤突变负荷和肿瘤微环境（tumormicroenvironment,TME）也逐渐被开发,然而它们的应用尚缺乏确凿的临床证据。值得注意的是,PD-L1表达的预测价值受多个因素的影响,包括不同的检测抗体和平台、判读标准的不一致以及PD-L1表达的时空异质性。事实上,抗PD-1/PD-L1免疫治疗在PD-L1阴性/低表达的癌症患者中也显示出一定的临床疗效,这表明仅仅依靠肿瘤PD-L1表达并不足以识别对PD-1/PD-L1阻断治疗敏感的患者。未来的研究可能有助于开发新的预测因子,特别是在PD-L1阴性/低表达患者中识别抗PD-1/PD-L1治疗的潜在应答者。法尼酯X受体（famesoid X receptor,FXR）是核受体超家族的成员,主要在肝脏和胃肠道中表达。作为一种胆汁酸（bile acid,BA）激活的转录因子,FXR参与调节与BA动态平衡、脂肪和葡萄糖代谢相关的靶基因表达。以往的研究揭示了 FXR作为致癌基因或抑癌基因在肝癌、结直肠癌、食管癌和乳腺癌等肿瘤发生发展中的重要作用。已有报道称,与癌旁肺组织相比,FXR在NSCLC肿瘤组织中的表达显著上调,FXR可通过反式激活细胞周期蛋白cyclin D1促进NSCLC细胞增殖。此外,NSCLC肿瘤组织中FXR与PD-L1蛋白表达呈显著负相关,FXR可以直接与PD-L1启动子中的FXR反应元件结合来抑制PD-L1转录。值得注意的是,与对照组肿瘤相比,FXRhighPD-L1low小鼠Lewis肺癌对PD-1阻断显示出更好的治疗反应。然而,FXRhighPD-L1low表型是否能预测临床NSCLC患者对免疫相关治疗的临床反应尚未得到研究。目的:本研究旨在探讨FXR在临床NSCLC以抗PD-1为基础的免疫联合化疗中的预测价值,其中主要针对PD-L1阴性/低表达患者。此外,通过探讨FXR表达与肿瘤浸润性CD8+T细胞之间的相关性来揭示这其中的潜在机制。本研究将为PD-L1阴性/低表达NSCLC患者免疫相关治疗预测性标志物的开发提供新的有力临床证据。方法:1、临床资料收集:共纳入149名在山东省立医院接受以抗PD-1为基础的免疫联合化疗治疗的晚期NSCLC患者。通过电子病历系统收集包括年龄、性别、吸烟史、组织学类型、TNM分期、ECOG PS评分、治疗方案、免疫治疗线数等在内的临床和病理资料。根据实体瘤疗效评价标准1.1版进行肿瘤评估,并将完全缓解或部分缓解的患者归为有反应组,疾病稳定或进展患者归为无反应组。通过病历或电话随访获得患者的无进展生存期（progression-free survival,PFS）和总生存期（overall survival,OS）信息。2、免疫组化检测:所有患者均有可用于免疫组化（immunohistochemistry,IHC）分析的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的原发肿瘤标本。从每位患者的FFPE标本中取4μm厚的切片用于FXR、PD-L1和CD8 IHC染色。FXR和PD-L1的IHC结果以染色强度和百分比的乘积进行评分,并划分为低表达和高表达两组;对于CD8,选取4～6个代表淋巴细胞浸润最密集的高倍视野（HPFs,200X）,通过计算4～6个HPFs的CD8+T细胞平均值（cells/HPF）来反映CD8+T细胞的浸润程度,并根据中位数划分为低表达和高表达。3、统计分析:定量数据的正态性检验采用Shapiro-Wilk法。采用Mann-Whitney U检验对偏态分布数据进行组间比较。采用Spearman等级相关分析评价各蛋白免疫组化表达的相关性。采用卡方检验或Fisher’s确切概率法进行分类变量的比较。生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法,组间比较采用log-rank检验。此外,采用Cox回归模型探讨FXR、PD-L1表达和临床病理因素对NSCLC患者生存期的影响。以上分析借助统计软件 SPSS Statistics 26.0（IBM Corp.）和 GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software,Inc.）完成。P值＜0.05被认为具有统计学意义。结果:1、患者基线特征:纳入队列的149名患者中有男性119例,女性30例,老年人比例较高,大多数患者有吸烟史。其中,FXR高表达组患者有78例（52.3%）,PD-L1高表达组有54例（36.2%）。149例NSCLC中以非鳞状细胞癌为主,其中腺癌90例,肉瘤样癌2例,大细胞神经内分泌癌1例。一半以上（103/149,69.1%）的患者在治疗开始时TNM分期已达Ⅳ期。所有患者均接受以抗PD-1为基础的免疫联合化疗作为一线方案或前期化疗、放疗或靶向治疗后进展的更高线方案。其中,应用最多的PD-1抑制剂为卡瑞利珠单抗（111/149,74.5%）。2、疗效与生存分析:在所有患者中,FXR和PD-L1高表达与较高的客观缓解率（objective response rates,ORR）相关（P 值分别为 0.036 和 0.002）。并且 PD-L1 高表达患者也表现出更长的PFS（P=0.031）。值得注意的是,我们发现FXR和PD-L1在NSCLC肿瘤组织中的表达呈显著负相关。亚组分析显示,在PD-L1低表达组患者中,FXR高表达与更高的ORR（P=0.009）、更长的PFS（P= 0.013）和OS（P=0.03）相关。Cox多因素回归分析显示,FXR高表达是PD-L1低表达组患者PFS（P=0.038;HR,0.552;95%CI,0.315-0.967）和 OS（P=0.029;HR,0.377;95%CI,0.157-0.905）的独立预测因子。3、肿瘤微环境评价:最后,我们尝试从TME的角度解释FXR对NSCLC以抗PD-1为基础的免疫联合化疗的预测价值。由于CD8+T细胞是TME中最重要的效应细胞,也是PD-1/PD-L1免疫检查点通路的主要靶点,因此我们检测了 CD8+T细胞在NSCLC肿瘤组织中的浸润情况。结果显示,FXR高表达的NSCLC组织中CD8+T细胞浸润显著减少。结论:1、在接受以抗PD-1为基础的免疫联合化疗的所有NSCLC患者中,FXR和PD-L1高表达与较高的ORR相关,并且PD-L1高表达预示着更长的PFS。2、FXR与PD-L1在NSCLC肿瘤组织中的表达呈显著负相关。在接受免疫联合化疗的PD-L1阴性/低表达NSCLC患者中,FXR高表达与更高的ORR、更长的PFS和OS相关,FXR是这些患者PFS和OS的独立预测因子。3、NSCLC肿瘤组织中FXR和CD8表达呈显著负相关,这提示在FXR高表达的肿瘤中,受抑制的CD8+T细胞比完全激活的CD8+T细胞更容易对PD-1阻断治疗产生应答。综上,本研究推荐将FXR作为PD-L1阴性/低表达NSCLC中以抗PD-1为基础的免疫联合化疗临床疗效的预测因子,为免疫相关治疗补充性生物标志物的开发提供了临床证据。