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目的:高危神经母细胞瘤患儿预后不良,目前治疗手段以手术及放化疗为主,仍有超过半数患儿出现治疗后复发。相关研究表明,低剂量化疗可促使肿瘤细胞衰老,可以抑制肿瘤增殖的同时减轻药物不良反应,然而部分衰老细胞通过分泌抑制性细胞因子影响机体免疫应答,可能作为肿瘤免疫逃逸的重要机制。其中,NK细胞和一些T细胞亚群上的自然杀伤活化性受体2D（Natural Killer Group 2D,NKG2D）在免疫监视中发挥着重要作用,肿瘤细胞通过脱落多种NKG2D配体达到抑制机体抗肿瘤免疫的目的。本课题主要研究化疗诱导衰老的神经母细胞瘤通过旁分泌与外泌体两种途径释放NKG2D配体,抑制NK细胞杀伤功能,从而实现免疫逃逸的分子机制。方法:使用小剂量化疗药物多柔比星（Doxorubicin,DOX）与Aurora A抑制剂MLN8237分别作用于四株神经母细胞瘤细胞系构建衰老模型,ELISA检测衰老细胞NKG2D 配体 MICA/B（MHC Class I Polypeptide-related Sequence A/B,MICA/B）分泌情况。从衰老细胞及正常生长期肿瘤细胞培养基上清中提取外泌体,流式细胞术检测外泌体MICA/B的表达及其对NK细胞NKG2D受体的影响。蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）、RT-qPCR及免疫荧光检测衰老细胞去整合素金属蛋白酶10（A Disintegrin And Metalloproteinase 10,ADAM10）表达水平。使用 ADAM10 抑制剂GI254023X联合化疗,检测MICA/B分泌情况并使用钙黄绿素法（calcein-AM）检测NK细胞杀伤功能。利用双荧光素酶法验证长链非编码RNA（Long Non-coding RNA,lncRNA）MALAT1/microRNA-92a（miR-92a）/ADAM10 之间的调控关系,通过脂质体转染 siRNA 敲低 MALAT1,证实 lncRNA MALAT1/miR-92a/ADAM10 轴在 NKG2D介导的免疫逃逸中的作用。结果:1.衰老的神经母细胞瘤细胞通过旁分泌及外泌体释放MICA/B抑制NK细胞功能。神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y经2 μM MLN8237或0.5 μM化疗药物DOX处理72h后,镜下观察β-半乳糖苷酶染色显示细胞蓝染,细胞周期结果提示出现G2/M期阻滞,即成功构建细胞衰老模型;四株不同的神经母细胞瘤细胞系SK-N-BE（2）、IMR-32、SK-N-SH、SH-SY5Y采用相同处理诱导衰老后,ELISA检测结果显示不同神经母细胞瘤细胞NKG2D配体MICA/B分泌均有增加;采用差速离心法分别从2μM MLN8237诱导衰老的IMR-32细胞或未处理组细胞培养基上清中分离外泌体,流式细胞术检测结果显示MICA/B在衰老细胞及外泌体中表达均高于未处理组;此外,将分离的外泌体与NK细胞共培养,流式细胞术检测结果显示神经母细胞瘤细胞可释放含有MICA/B的外泌体,抑制免疫细胞NKG2D受体的表达。2.衰老细胞ADAM10表达促进MICA/B释放并抑制NK细胞杀伤功能。IMR-32 细胞经 2 μM MLN8237 或 0.5 μM DOX 处理 72 h 诱导衰老,Western blot、RT-qPCR及免疫荧光结果显示ADAM10表达显著上调;将ADAM10抑制剂GI254023X 5 μM与上述药物共同处理72 h,以单用化疗药物处理的IMR-32细胞作为对照,ELISA及流式细胞术结果显示相比于MICA/B的分泌抑制,细胞膜上表达上调;各组细胞与NK细胞共培养检测杀伤效率,结果显示联合用药方案可以上调NK细胞识别与杀伤能力。3.lncRNA MALAT1通过竞争性抑制miR-92a调控ADAM10的表达。2 μM MLN8237或0.5 μMDOX处理72 h诱导衰老的IMR-32细胞MALAT1表达上调,而miR-92a出现下调;双荧光素酶报告基因检测结果显示MALAT1与miR-92a以及miR-92a与ADAM10之间存在结合位点;在2 μM MLN8237或0.5 μMDOX作用下,转染si MALAT1可从蛋白及RNA水平上抑制ADAM10的表达,同时诱导miR-92a上调;同时转染si MALAT1与miR-92a抑制剂可逆转上述现象。4.lncRNA MALAT1和miR-92a参与免疫逃逸的动态调节。IMR-32转染si MALAT1后使用2 μM MLN8237处理72h,未转染细胞作为对照组,ELISA检测结果显示MICA/B分泌减少,流式细胞术检测膜蛋白表达结果显示MICA/B细胞膜上表达上调,各组细胞与NK细胞共培养检测杀伤效率,结果显示抑制MALAT1可增加NK细胞杀瘤敏感性;同时转染si MALAT1与miR-92a抑制剂后使用2 μM MLN8237诱导衰老可逆转上述现象。结论:本研究证实了小剂量化疗可诱导神经母细胞瘤衰老,并通过lnc RNA MALAT1/miR-92a/ADAM10轴上调ADAM10的表达,促进肿瘤细胞NKG2D配体MICA/B的脱落,同时部分MICA/B分子可经外泌体作用于NK细胞,共同参与构成抑制性SASP,降低NK细胞识别与杀伤能力,从而实现免疫逃逸,使用ADAM10抑制剂GI254023X或siRNA敲低MALAT1联合化疗可抑制衰老细胞MICA/B分泌,增强细胞膜MICA/B表达水平,提高NK细胞识别并杀伤衰老细胞的能力。