论文部分内容阅读
β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2M)作为临床检测的一项重要指标,在肾脏功能的评价以及恶性肿瘤的辅助诊断等方面具有非常重要的作用。目前,关于β2M体外免疫检测方法的研发通常直接采用结构复杂的单克隆抗体,开发周期长且生产成本较高。本论文以具有体积小、稳定性好、生产成本低等优点的纳米抗体为基础,发展一种新型的β2M的检测方法。为保证纳米抗体结构和活性的稳定性,对抗β2M纳米抗体进行酶法定点生物素化修饰,并探究其用于酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测β2M的可行性。具体研究内容如下:(1)抗β2M纳米抗体的制备及其活性表征:利用基因工程手段在纳米抗体序列末端添加生物素化标签AviTag和纯化标签6×HisTag,构建了3种载体4种宿主共12种重组表达菌株。经筛选最终选择以pET23a-β2Mnb为表达质粒、E.coli Shuffle T7(DE3)为表达宿主的重组菌株进行大量表达。通过金属离子螯合层析获得高纯度的纳米抗体后,分别用ELISA法和Biacore操作系统分别定性、定量测定纳米抗体的活性。结果表明纯化获得的抗β2M纳米抗体具有抗原结合活性,平衡解离常数为1.007×10-6 M。(2)BirA酶的制备及纳米抗体的生物素化修饰:首先构建生物素连接酶(BirA酶)的E.coli Shuffle T7(DE3)重组表达菌株。通过诱导表达和分离纯化获得的BirA酶纯度达85%以上,BirA酶的一个酶活力单位等于0.57 ng,比活力为1754 U/μg。之后,将具有催化活性的BirA酶用于纳米抗体的酶法定点生物素化修饰。通过优化酶催化反应体系,抗β2M纳米抗体的生物素化效率可达到98%以上。ELISA实验结果表明生物素化的纳米抗体仍具有抗原结合活性。(3)生物素化纳米抗体用于ELISA法检测β2M的效果研究:基于定向固载生物素化纳米抗体的ELISA检测方法对纯溶液中β2M的检测线性范围为3-800 ng/m L,检测下限远小于1 ng/m L。用于检测人血清样品时,抗β2M纳米抗体对血清中的主要蛋白质存在非特异性结合,影响了检测结果的准确度。总之,本论文成功利用BirA酶实现抗β2M纳米抗体的定点生物素化修饰,一方面为制备抗β2M纳米抗体和BirA酶提供了较优的生产工艺,另一方面为纳米抗体的生物素化修饰提供了最优的实验方案。同时,本研究结果证明了生物素化抗β2M纳米抗体用于ELISA法检测β2M的可行性。为解决因非特异性结合导致的检测准确度不理想的问题,采用特异性更高的纳米抗体是未来解决该问题的突破口。