第一部分表皮松解性掌跖角化症基因型-表型相关性分析及产前基因诊断背景：表皮松解性掌跖角化症(epidermolytic palmoplantar keratoderma, EPPK。 OMM:144200)是相对常见的致残性常染色体显性遗传性皮肤病。角蛋白9基因(KRT9)为EPPK的主要致病基因,外显率100%。目的：绘制本研究所收集到的EPPK家系基因突变谱,分析EPPK表型与致病基因KRT9基因型之间的相关性。根据患者的需要,在致病突变明确后进行产前基因诊断。方法：收集了12个汉族EPPK家系,采集外周血样本,利用PCR-DNA测序、AS-PCR, DHPLC及RFLP确定和验证相关KRT9基因和KRT1基因突变类型。继而,对4个家系的高风险患病胎儿进行了产前基因诊断。结果：(1)在本研究所涉及的11个EPPK家系或散发病例中存在5种KRT9杂合突变,分别为c.C487T (p.Arg163Trp)、c.T470C (p.Met157Trp)、c.T1373C (p.Leu458Pro)、c.G488A (p.Argl63Gln)、c.A482G (p.Asn161Ser),并且c.C487T (p.Arg163Trp)为发生频率最高的突变型,占41.7%(5/12)；一个EPPK家系患者未发现任何KRT9或KRT1基因突变；(2)除了典型的掌跖部表皮弥漫性增厚外67%(8/12),EPPK家系患者还存在指节垫表型,且大部分患者形成的指节垫与外力摩擦无关联,提示指节垫可能是KRT9突变引起的另一个原发症状；3个家系的部分患者还伴发先天性指屈曲表型,其KRT9突变为p.Asn161Ser和p.Leu458Pro,推测先天性指屈曲还可能与环境因素有关；(3)利用羊水DNA-PCR-Sanger测序的方法,成功地完成了4例产前基因诊断,其中3例为正常胎儿,1例为致病突变携带胎儿。结论：KRT9突变基因型和EPPK表型之间存在复杂的相关性,遗传异质性可能受环境因素、多态性核苷酸位点或修饰基因等未知因素的影响。指节垫可能为KRT9突变引起的另一个原发症状,而先天性指屈曲的形成可能受环境因素影响较大。开展基于KRT9基因突变检测的产前DNA诊断对于EPPK的预防非常关键。第二部分表皮松解性掌跖角化症KRT9基因突变敲入小鼠模型的构建背景：建立EPPK的动物模型,不仅可为探讨疾病发生的分子和细胞生物学机制提供线索,而且可以作为一种理想的活体用于疾病的基因治疗、新药研发等诸多研究。目的：为了更好地在成体和细胞水平上了解EPPK的发生发展和K9蛋白的功能,为EPPK的后续基因治疗和临床用药治疗等研究奠定坚实的理论及实践基础。方法：通过构建与EPPK患者KRT9突变c.500delAinsGGCT同源性的小鼠Krt9基因c.434delAinsGGCT突变载体,利用同源重组原理基因打靶小鼠胚胎干细胞-囊胚注射后,移植到假孕鼠子宫获得嵌合鼠的出生。通过嵌合鼠与野生型母鼠的配繁,筛选得到稳定遗传的Krt9基因突变敲入小鼠。通过表型分析、组织学检测、蛋白印迹实验和免疫组化分析等系统评估小鼠的表型,初步探讨EPPK发病的分子机制。结果：(1)Krt9/c.434delAinsGGCT杂合突变小鼠在出生后3-4周即出现前、后爪足垫区皮肤黑色过度角化斑,且随着时间的推移更加趋向明显。表型出现增厚-蜕皮-增厚的变化,周期为3周左右；(2)石蜡切片H&E染色结果显示,突变小鼠足垫区皮肤角质层增厚,棘层、颗粒层细胞增多和空泡样改变。扫描电镜分析显示,突变小鼠足垫区皮肤出现破裂松解性改变,透射电镜观察到在棘层、颗粒层细胞中存在空泡样改变和黑色异常蛋白聚集颗粒物的出现；(3)蛋白表达分析结果显示,在突变小鼠足垫区表皮中出现K5、K2蛋白表达量的下调,K10、K6和K16蛋白表达量的上调；(4)免疫组化分析结果显示,丝聚合蛋白和外披蛋白的表达量增加；Ki-67和p63蛋白表达量和分布发生改变。结论：Krt9/c.434delAinsGGCT突变敲入小鼠在遗传方式和表型上都高度模拟人EPPK的发生、发展,为理想的疾病模型。突变的K9蛋白可能阻碍了正常K9／K1二聚体的形成,从而导致作为小鼠机械承受力最大的足垫区表皮细胞骨架的崩塌,K2角蛋白的减少和抗压能力较弱的其他角蛋白--K10、K6和K16代偿性地表达增高,可能使得上基底层细胞发生细胞溶解。而基底细胞的过度增殖使得棘层、颗粒层细胞数量增多和不规整排列,可能最终导致了Krt9/c.434delAinsGGCT突变小鼠出现EPPK相似的角化过度和皮肤松解症状。