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氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase,aaRS)催化tRNA的氨基酰化反应,生成氨基酰-tRNA,为蛋白质生物合成提供原料。除了精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)、谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS)和谷氨酰氨酰-tRNA合成酶(GlnRS),其他17种aaRS通过两个步骤催化氨基酰化反应:氨基酸活化和活化氨基酸的转移。为保证遗传密码表达的精确性,相似氨基酸对应的aaRS具有编校功能,通过水解去除误活化的氨基酸和/或误氨基酰-tRNA。亮氨酰-、异亮氨酰-及缬氨酰-tRNA合成酶(LeuRS,IleRS,ValRS)通过氨基酸转移到tRNA分子上以后的编校,简称“转移后编校”水解错误的氨基酰化产物。这类AARS的编校结构域是插入活性中心称为CP1(Connective Peptide1)的插入肽段。
我们首次克隆了来自于古老单细胞真核生物贾第虫(Giardia lamblia)编码LeuRS的基因,通过体外表达基因纯化了Giardia lamblia LeuRS(GlLeuRS),研究了该酶的基本性质和催化动力学性质。发现,来自于GlLeuRS的单独的CP1结构域肽(GlLeuRS-CP1)具有独立的编校能力,其中一段简称为49-aa结构模体(49-aa motif)的49个氨基酸残基的独特的插入片段对于GlLeuRS最佳氨基酰化能力和GlLeuRS-CP1行使编校功能至关重要,该49-aa结构模体能赋予原本不具有编校能力的大肠杆菌LeuRS单独的CP1结构域肽(EcLeuRS-CP1)以编校能力。此外,还发现,GlLeuRS在体内和体外都不能有效地氨基酰化来源于酿酒酵母的tRNALeu,揭示了GlLeuRS与酵母LeuRS(ScLeuRS)之间在识别tRNA方式上有差异。
所有的LeuRS都具有一段称为连接肽段2(connective peptide2,CP2)的结构域。依据物种差异性,在一级结构上,CP2结构域位于CP1结构域之前或者之后。所有物种的CP2结构域的二级结构和三级结构相似。尽管大量的研究证明CP1结构域负责LeuRS行使氨基酸编校功能,但CP2结构域的功能尚不明确。在本研究中,通过针对GlLeuRS中的CP2结构域的缺失突变,我们发现CP2结构域对于氨基酸的活化和转移后编校至关重要;同时,该结构域还参与最优的LeuRS与tRNALeu之间的相互作用。此外,在细菌类LeuRS和真核/古菌类LeuRS中,CP2结构域的功能都很保守。丙氨酸扫描试验(Ala scanning)和定点突变试验鉴定了几个对于以上功能具有关键作用的氨基酸残基,并且阐明了它们发挥作用的可能机理。最后,通过嵌合酶试验,我们还发现,来自PhLeuRS的CP2结构域可以一定程度地在功能上代偿GlLeuRS CP2的功能,而来自EcLeuRS的CP2结构域却不能代偿,说明了CP2结构域功能依赖于其在LeuRS上的位置。
一系列处于不同构象的LeuRS与tRNALeu的共晶结构表明,tRNALeu的3末端必须高度动态且特异地在氨基酰化结构域和CP1编校结构域之间穿梭。在本研究中,我们发现,Giardia lamblia CP1编校结构域水解活性中心外的两个酪氨酸残基(Tyrosine),Y515和Y520,通过影响CP1结构域与错误的氨基酰化tRNA3末端之间的结合亲和力对转移后编校起重要作用。在Y515和Y520上的点突变还一定程度地影响了Leu-tRNALeu的合成,但对氨基酸的活化没有影响。我们的实验结果给出了真核/古菌类LeuRS的CP1结构域与错误的氨基酰化tRNALeu3末端之间相互作用的生物化学信息。
亮氨酰-tRNA合成酶是多结构域的蛋白质分子。在真核/古菌类LeuRS中,普遍存在着一个插入片段,称为亮氨酸专一结构域1(leucine-specific domain1,LSD1),但是它们的一级结构在真核生物LeuRS和古细菌LeuRS中存在较大差异。相对古细菌LeuRS而言,真核生物LeuRS的LSD1存在着一段高度保守且富含赖氨酸残基的插入片段(insertion fragment,INS)。研究结果表明,真核生物LeuRS和古细菌LeuRS的LSD1在行使功能上存在差异性;真核生物LeuRS的INS中的不同亚片段分别负责氨基酰化反应的两个反应步骤,但对于氨基酸编校反应都没有影响。我们通过点突变详细分析了这些关键的氨基酸残基行使功能的机理。此外,真核生物LeuRS和古细菌LeuRS的LSD1在功能上不能互相取代。我们的结果使我们对于LeuRS-tRNALeu的相互作用有了更加深入的认识,但还需进一步的实验来确切阐明该结构域所行使的功能。