论文部分内容阅读
目的:探讨羟基脲诱导K562细胞γ-珠蛋白表达过程中P38MAPK信号的调控作用及机制,为明确羟基脲诱导γ-珠蛋白表达的作用机制提供新的实验依据。方法:将终浓度设为0μM、100μM、200μM、300μM、400μM的羟基脲分别作用于K562细胞,选取4个不同观察时间点(24h、48h、72h、96h)进行检查。RT-PCR检测不同浓度羟基脲作用不同时间后K562细胞γ-珠蛋白基因mRNA表达水平;CCK-8试剂盒检测不同浓度羟基脲作用不同时间后K562细胞存活率;流式细胞术检测不同浓度羟基脲作用后K562细胞凋亡率,筛选出羟基脲最佳作用浓度和时间,并以该条件评估羟基脲作用后BCL11A等相关转录因子表达的差异性。随后设立羟基脲实验组、羟基脲+SB203580实验组、等体积SB203580抑制剂组和PBS阴性对照组,采用RT-PCR进一步检测γ-珠蛋白基因、P38MAPK以及相关转录因子基因mRNA表达水平,western blot检测γ-珠蛋白、P38MAPK总蛋白和磷酸化蛋白表达水平。结果:1、筛选羟基脲最佳作用浓度和时间,结果显示不同浓度、时间作用下K562细胞γ-珠蛋白基因mRNA表达水平差异有统计学意义(F=352.387,P=0.000;F=823.875,P=0.000),且浓度与时间之间存在交互作用(F=303.642,P=0.000),其中羟基脲300μM浓度作用72h对γ-珠蛋白基因mRNA表达的诱导作用最强,其次为400μM浓度作用96h。2、CCK-8检测羟基脲对K562细胞存活率的影响,K562细胞存活率同时受时间(F=464.901,P=0.000)和浓度(F=196.683,P=0.000)影响,且两者之间存在交互作用(F=11.779,P=0.001),随着羟基脲浓度的增大和作用时间的延长,K562细胞存活率逐渐下降,相同浓度不同时间点之间以及相同时间不同浓度之间两两比较细胞存活率差异均有统计学意义(P=0.000)。3、流式细胞仪检测羟基脲对K562细胞凋亡率的影响,结果显示不同浓度间细胞早期凋亡率、晚期凋亡率以及总凋亡率差异均具有统计学意义(F=3.802,P=0.039,F=6.298,P=0.043,F=7.709,P=0.004)。羟基脲作用7h后,K562细胞凋亡率存在一定浓度依赖性,浓度越大,细胞凋亡率越大。4、羟基脲作用K562细胞后相关转录因子基因mRNA表达水平,结果显示,羟基脲作用后BCL11A基因mRNA的表达水平明显降低,是对照组的0.21倍(P=0.000),而转录因子GATA1、TAL1、SOX6和KLF1基因mRNA表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P=0.052,P=0.115,P=0.590,P=0.447)。5、羟基脲实验组、羟基脲+SB203580实验组等不同处理组K562细胞γ-珠蛋白基因mRNA表达水平,结果显示,各组间γ-珠蛋白基因mRNA表达水平差异有统计学意义(P=0.000),羟基脲组γ-珠蛋白基因mRNA表达量较其他各组均显著增高(P=0.000),分别是对照组、羟基脲+SB203580组和SB203580组的5.75倍、3.48倍和8.21倍,而羟基脲+SB203580组和SB203580组较对照组无显著性差异(P=0.052,P=0.324)。6、羟基脲实验组、羟基脲+SB203580实验组等不同处理组K562细胞γ-珠蛋白表达水平,结果显示,各组间γ-珠蛋白表达水平差异有统计学意义(P=0.001),羟基脲组γ-珠蛋白表达量较其他各组均明显增高,分别是对照组、羟基脲+SB203580组和SB203580组的1.42倍(P=0.004)、2.06倍(P=0.000)和1.74倍(P=0.000),而SB203580组与对照组和羟基脲+SB203580组差异无统计学意义(P=0.119,P=0.260)。7、羟基脲实验组、羟基脲+SB203580实验组等不同处理组K562细胞P38MAPK基因mRNA表达水平,RT-PCR结果显示,各组中P38MAPK基因mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.234)。8、羟基脲实验组、羟基脲+SB203580实验组等不同处理组K562细胞总P38MAPK蛋白及磷酸化P38MAPK蛋白表达水平,Western blot结果显示,不同处理组细胞P38MAPK总蛋白表达水平差异无统计学意义(P=0.132);各组间磷酸化P38MAPK蛋白表达水平差异有统计学意义(P=0.000),其中羟基脲组磷酸化P38MAPK蛋白表达水平较其他各组均明显升高(P=0.000),其余各组之间比较差异无统计学意义。9、羟基脲实验组、羟基脲+SB203580实验组等不同处理组K562细胞各转录因子基因mRNA表达水平,结果显示,不同处理组BCL11A基因mRNA表达水平差异有统计学意义(P=0.000),羟基脲组BCL11A基因mRNA表达水平明显低于其他各组(P=0.000),分别是对照组、羟基脲+SB203580组和SB203580组的0.38倍、0.31倍和0.28倍,羟基脲+SB203580和SB203580两组比较差异无统计学意义(P=0.237);而不同处理组KLF1、GATA1、SOX6和TAL1基因mRNA表达水平差异均无统计学意义(P=0.249,P=0.126,P=0.981,P=0.476)。结论:1、本研究表明羟基脲可通过抑制BCL11A基因表达诱导K562细胞γ-珠蛋白基因mRNA表达;2、本研究显示羟基脲通过增强P38MAPK磷酸化水平激活P38MAPK信号诱导K562细胞γ-珠蛋白基因mRNA和γ-珠蛋白表达;3、本研究证实羟基脲可通过激活P38MAPK信号抑制BCL11A基因表达进而诱导γ-珠蛋白表达。