论文部分内容阅读
目的 研制能够模拟真实临床样本且无生物传染危险性的沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,CT)PCR检测质摔物,并进行稳定性研究.方法 在充分查阅文献的基础上,明确国内外已有文献报道的CT:PCR检测的靶序列,选择最普遍应用的CT质粒序列,采用重叠(overlap)PCR、分子克隆等技术构建含有所选择的常用检测目的 CT质粒序列的重组真核表达载体,即pTARGETTM-CT 质粒.然后,将载体以脂质体转染的方式转染入宫颈上皮细胞(HTB-SiHa细胞)中,收集细胞,经含20%小牛血清的细胞培养液稀释,即成为能模拟CT检测临床样本的细胞质控物.最后观察得到的质控物对目前国内常用商品试剂盒的适用性及在4℃、37℃及室温条件下的稳定性.结果 成功构建了含CT质粒(178-610)、(1219-1993)、(2471-3260)、(5239-5864)、(6722-7499)等5个片段的重组真核表达载体,并转入HTB-SiHa细胞中,得到了可模拟临床样本的CT PCR检测的质控物.采用深圳匹基生物工程有限公司、中山大学达安基因股份有限公司商品CT PCR检测试剂盒对转染后样本进行检测,得到阳性结果;定量为3.21×108拷贝/ml;倍比稀释后较高浓度样本检测结果呈梯度下降、10倍稀释循环阈值相差约3.3;对不同浓度稀释后在4℃、37℃及室温条件下保存1个月的样本的检测结果进行随机区组的两因素方差分析后发现,在各温度下保存的样本经检测后的结果问差异无统计学意义,所构建的质控样本至少可以稳定保存1个月.结论 利用重叠PCR与双酶切的方法,建立了一种将多间隔片段连接并构建入同一载体的简便有效的方法.成功地得到了可模拟临床标本的CT PCR检测质控物。