【摘 要】
：
本研究以传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurateRT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA.序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5,,3,端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,,基因组B节段全长共2843
【机 构】
：
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001
【出 处】
：
中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次学术研讨会
论文部分内容阅读
本研究以传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurateRT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA.序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5,,3,端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,,基因组B节段全长共2843个核苷酸,包括5,、3端的非编码区和一个开放阅读框.将IBDV-Gx株的A节段全长基因组及B节段全长基因组分别克隆入PMD-18载体,构建成PMD-A、PMD-B两个带有T7启动子的重组质粒.两个重组质粒线性化后,进行体外转录然后共电转染于鸡胚成纤维细胞37℃培养72h并传代.收获细胞培养物传代后分别用RT-PCR、间接免疫荧光、蚀斑试验等方法进行鉴定,结果用RT-PCR扩增出了VP3及VP5基因片段,间接免疫荧光检测到了特异性的荧光抗体,蚀斑试验结果计算蚀斑形成单位为3×103PFU/mL。
其他文献
将编码猪瘟病毒(CSFV)主要保护性抗原的E2基因克隆至真核表达载体pVAX1,构建了含CSFVE2基因的真核表达质粒pVAXE2.将其电转化猪霍乱沙门氏菌C500疫苗株,构建了携带pVAXE2质粒的重组菌S.C500/pVAXE2,并对重组菌形态特征、培养特性和生化特性进行了鉴定.分别用1×108CFU、2×109CFUS.C500/pVAXE2经口服或肌肉注射免疫小鼠及家兔,用间接ELISA检
根据伪狂犬病病毒(PRV)Fa株糖蛋白gD基因序列,设计了1对特异性引物,应用PCR方法成功地从重组质粒pB13中扩增出了糖蛋白gD基因去信号肽片段.随后,将此片段克隆到大肠杆菌表达载体pThiohisA中,测序结果表明糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp,序列与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致.经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导后,重组质粒pThiohisA-gD在宿主菌XL1-blu
根据伪狂犬病病毒Becker株的gC基因序列,设计并合成了1对特异性引物,通过PCR方法从我国伪狂犬病病毒代表毒株Fa株的基因组DNA中扩增到了1条约1.6kb的片段.将PCR扩增产物纯化后克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌,筛选阳性重组质粒.通过酶切鉴定,初步证明重组质粒pMD18-T-FC包含PCR扩增产物.将此重组质粒进行测序并与报道的gC基因序列比较,确证重组质粒pMD18-T-FC
将本课题组构建的共表达FMDV复合多表位基因以及猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTA2-OAT以及DNA疫苗pVRI-OAT,分别以vUTA2-OAT/vUTA2-OAT、pVRI-OAT/vUTA2-OAT和vUTA2-OAT/pVRI-OAT等3种方式接种牛,然后通过间接ELISA、中和试验和T淋巴细胞增殖试验评价其诱导的特异性体液和细胞免疫水平.结果表明这3种策略均能诱导牛产
经反转录聚合酶链式反应(Revers-TranscriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)扩增了SARS冠状病毒(SARS-CoV)BJ01株的PU5基因(putativeuncharacterizedgene5)的cDNA,将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,命名为pGEX-PU5,测序正确后将阳性质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表
使用灭活的SARS病毒免疫SPF鸡,定期收集鸡蛋.用水稀释法提取鸡蛋中的IgY,将其进一步纯化,制备了抗SARS病毒卵黄抗体.经SDS-PAGE、Western-blot及中和试验结果表明纯化后的卵黄抗体具有较高的纯度和反应活性,中和效价可达1:640.冻干及稳定性试验的结果表明,冻干后的卵黄抗体物理性状、反应活性及稳定性良好.
目的获得五指山猪内源性反转录病毒5端非编码区(5UTR)cDNA,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础.
方法采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆来源于五指山猪的内源性反转录病毒(PERV-WZS)5UTR,并通过NCBI公共数据库BLASTN序列进行同源性分析,应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析.
结果通过RACE方法获得
应用不同引物将PRRSBJ-4毒株ORF5缺失信号肽的dE基因及其缺失突变体dEM分别克隆至原核高效表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-6P-dE、pGEX-6P-dEM,转化大肠杆菌BL21细胞,经诱导获得重组融合蛋白(GST-dE,GST-dEM),表达量分别为16％,32％.分别经包涵体变性、复性,GST亲和层析、凝胶层析等获得纯化的重组蛋白GST-dEM、GST-dE.应用
以纯化的口蹄疫(FMD)非结构蛋白3ABC作为捕捉抗原,金标口蹄疫抗原作为金标试剂,建立检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的胶体金免疫层析试纸条(ICS).同时,应用FMDICS试验和UBIFMD非结构蛋白酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对反刍动物、猪标准阳性血清的不同滴度进行检测,结果表明ICS检测反刍动物时的敏感性与ELISA接近,而检测猪时其敏感性低于UBI的ELISA试剂盒.特异性试验证
为了研究鸡包涵体肝炎过程中单核巨噬细胞分子免疫机理.本研究采用200只1日龄SPF雏鸡,2日龄时接种FAV-8型禽腺病毒100只,分别在1,3,5,7,9,12,15,20,25,30日龄时,取攻毒组和对照组各10只,心脏采血致死,制备血液、脾脏白细胞悬浮液,用流式细胞仪检测血液和脾脏中单核巨噬细胞的变化,血液中单核细胞的凋亡规律.结果显示:脾脏Ia+Mφ只在攻毒后第25d有显著提高,第1、5到7