【摘 要】
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目的 采用人肝癌细胞HepG2、大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E、大鼠心肌细胞H9c2建立的体外模型,研究雷公藤甲素(TP)对Nrf2-ARE防御系统的激活作用,并探讨Nrf2-ARE防御系统与TP所引起的细胞凋亡及氧化应激的相关性.选用体内试验研究激活Nrf2-ARE防御系统保护TP对BALB/C小鼠的急性肝、肾、心脏损伤,从而为TP的配伍减毒提供参考.方法 采用免疫荧光法、Q-PCR法和Wes
【机 构】
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中山大学药学院,广州,510006
【出 处】
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2016(第二届)毒性测试替代方法与转化毒理学(国际)学术研讨会暨有害结局路径(AOP)与风险评估培训会议
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目的 采用人肝癌细胞HepG2、大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E、大鼠心肌细胞H9c2建立的体外模型,研究雷公藤甲素(TP)对Nrf2-ARE防御系统的激活作用,并探讨Nrf2-ARE防御系统与TP所引起的细胞凋亡及氧化应激的相关性.选用体内试验研究激活Nrf2-ARE防御系统保护TP对BALB/C小鼠的急性肝、肾、心脏损伤,从而为TP的配伍减毒提供参考.方法 采用免疫荧光法、Q-PCR法和Western Blot法测定TP对Nrf2转位入核水平、Nrf2及其下游靶基因(GCLC、HO-1、NQO-1)表达的影响.通过转染Nrf2过表达质粒与小干扰RNA,结合MTT法、Western Blot法、LDH法、ROS检测、GSH检测的方法,研究TP细胞毒性的变化.体内试验中,动物模型给药后进行血清生化学检测与靶器官组织病理学检查.将动物靶器官组织匀浆后,检测超氧化物歧化酶等酶的活性及GSH含量,Nrf2转位入核水平及Nrf2下游靶基因的转录水平.结果 1、不同浓度的TP在给药早期能应激性上调肝细胞、肾细胞、心肌细胞、小鼠肝脏组织、肾脏组织、心脏组织Nrf2及GCLC、HO-1、NQO-1的mRNA水平、蛋白水平、Nrf2转位入核水平.而在给药后期均被抑制至基线水平以下,且呈现出浓度和时间依赖性.2.TP能够剂量和时间依赖性地降低细胞活性, 增加细胞的LDH漏出率;降低SOD活性、GSH含量,上调ROS含量;降低线粒体膜电势,增加CytC外释;上调线粒体凋亡相关蛋白Apaf-1、Bax、Cleaved-Caspase3水平,下调Bcl-2水平.3.过表达Nrf2后,TP所引起的细胞活性下降程度明显降低,细胞损伤程度也显著下降.而TP所引起的细胞内Nrf2、NQO1、GCLC、HO-1表达水平的下降,与上调的Apaf-1、Bax、Cleaved-Caspase3均被显著缓解.基因沉默Nrf2后,TP可加重细胞活性的下降与氧化应激水平的上升.4.体内实验中,TP能升高小鼠血清中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、LDH含量,降低组织中SOD活性、GSH含量,上调线粒体凋亡相关蛋白水平,下调Bcl-2水平.而抗氧化剂莱菔硫烷(SFN)可通过激活Nrf2-ARE防御系统而对抗TP的毒性作用.结论 TP能够在肝、肾、心肌细胞和小鼠肝脏、肾脏、心脏组织中应激性地激活Nrf2-ARE防御系统,然后转为抑制.Nrf2-ARE防御系统能通过对抗氧化应激,保护TP诱导的细胞毒性.运用抗氧化剂SFN能够激活小鼠毒性靶器官中的Nrf2-ARE防御系统,对抗TP引起的氧化应激,为TP的配伍减毒及临床合理用药提供更加充分的依据.
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