【摘 要】
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为了建立稳定的猪血管内皮细胞系，为猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型，本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞，G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆，并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排
【机 构】
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吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130122
【出 处】
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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会
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为了建立稳定的猪血管内皮细胞系，为猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型，本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞，G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆，并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长，具有高度的增殖活性，在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征，并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Witlebrand factor，并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT-CD31和CD34，并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT，猪脐静脉血管内皮细胞已被成功地永生化，并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。
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细胞亲环蛋白A(cyPA)在多种病毒感染中起重要的调控作用。本实验室前期蛋白质组学研究发现，猪瘟病毒(csFv)感染后PK-15细胞的cyPA明显上调表达。为探讨cyPA在csFV复制与增殖中的作用，本研究首先采用环孢素A(CsA)处理PK-15细胞，特异性地抑制CyPA顺反异构酶活性，观察对CSFV的影响，在csA处理后24 h、48 h、72 h收集细胞和细胞冻融上清，进行病毒基因组拷贝数和病
前期的研究表明猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR与兔体定型热试验之间存在正相关性，本研究利用荧光定量RT-PcR方法对278批次猪瘟兔化弱毒疫苗进行检测，分别检测其疫苗含量及牛病毒性腹泻病毒污染情况。结果表明，278批次猪瘟疫苗中有66批(24％)疫苗含量达不到规程标准，有42批(15％)疫苗存在牛病毒性腹泻病毒污染；从中抽取6份荧光定量检测疫苗含量较低的疫苗用兔体定型热试验进行验证，两种方法结
为构建稳定表达猪瘟病毒(CSFV)Npro蛋白的PK-15细胞系，本研究采用PCR方法，以pOKl2／F1-9质粒为模板扩增Npro基因，并引入Flag标签序列，将其连到plRES2-EGFP载体，构建重组质粒pGFP-Npro；通过脂质体将pGFP．Npro转染至PK-15细胞中，利用G418加压筛选、纯化得到稳定表达Npro蛋白的细胞系；连续传代30代后，进行RT—PCR、Western bl
为了探讨猪圆环病毒2型(PCV2)作为表达外源表位的可行性，本研究构建了以PCV2基因组为骨架。在ORF2编码Cap蛋白的C末端插入了源自副流感病毒5型的一个含14氨基酸序列的V5表位标签，用构建感染性分子克隆重组质粒转染细胞，拯救出一株表达V5表位标签的重组毒株，命名为recPCV2／CL—V5。采用免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、血清中和试验(SNA)、捕获ELISA及免疫电镜对重组毒株进
RNAi(RNA interfererice)已成为特异抗病毒治疗研究的热点，但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siNl和siN2)在细胞中的表达水平，设计并以交叉组合方法筛选了具有较高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物(SLP-N1-6和SLP-N2-8)，成功地建立了最优的siNl和s
为评价猪圆环病毒(PcV)2a／2b两种基因型毒株及其重组cap蛋白(rCap)之间的交互免疫效果，本研究采用PCV2a-LG和PCv2b-YJ株制备了2种病毒灭活疫苗，及其重组杆状病毒表达的2种C印蛋白(PCv2a-rap和PCv2b-rap)亚单位疫苗。选用8周龄BALB／c鼠165只，随机分成11组，每组15只，用上述4种疫苗各免疫2组，以Pcv2a或Pcv2b毒株攻毒。攻毒后，所有鼠均未见
将纳米PCR技术引入非洲猪瘟病毒(AsFV)检测，建立了ASFV病毒高效纳米PCR检测方法。使用该方法同时检测大肠杆菌(E．coli)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒II型(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRsV)、猪捷申病毒(PTV-8)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)，结果只有ASFV病毒中P54基因扩增出552bp的目的片段。敏感性表明比普通PCR对照实验结果
为表达猪输血传播病毒1型(PTTV1)cap蛋白用于单克隆抗体(MAb)的制备，以含PTTV1全长基因组的质粒(pMD18-TTV1-SY13)为模板，用高保真PCR法扩增PTTV1-ORF1(1501～2475 nt)编码的Cap蛋白C末端截短序列(324 aa)，引物两端设计了salI和Not I酶切位点，将PcR产物克隆到pGEx-6P-1载体，构建的重组质粒命名为pGEx-TTV1-ORF
通过重叠延伸PCR(SOE-PcR)方法扩增猪细小病毒BQ-C株的NS2、NS3基因，并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)上，分别构建出重组表达质粒pEToNS2、pET-NS3。用不同浓度的IPTG进行诱导表达，SDS．PAGE分析表明pET-NS2重组蛋白在IPTG浓度为1．2 mM、温度为37℃、诱导4 h时表达量最大，分子量为25 ku；pET-NS3重组蛋白在IPTG浓度为1 m
为建立猪肺炎支原体(Mhp)显色原位杂交(CISH)定位检测方法，为本研究利用地高辛标记的MhpP36核酸探针和DAB／H2O2显色系统，对人工感染组、自然感染组和健康对照组的实验猪肺样品和临床样品进行显色原位杂交检测。结果显示，设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性，而与其他的猪病原菌无交叉反应；检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管／细支气管黏膜表面。此外，人工感染组、自然感染组和健