【摘 要】
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目的 旨在构建共表达人Sprouty2 基因与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体LV-Sprouty2-GFP,并通过感染获得稳定表达sprouty2 蛋白的骨髓瘤RPMI8226 细胞系,并观察Sprouty2 在
【机 构】
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徐州医学院移植免疫实验室 221002
【出 处】
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第四届全国血液肿瘤学术大会暨第七届全国淋巴肿瘤诊治进展研讨会
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目的 旨在构建共表达人Sprouty2 基因与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体LV-Sprouty2-GFP,并通过感染获得稳定表达sprouty2 蛋白的骨髓瘤RPMI8226 细胞系,并观察Sprouty2 在其中的表达.方法 根据GeneBank 数据库提供的Sprouty2 mRNA 序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,扩增出Sprouty2 全长片段,克隆至pMD-18T 载体.将Sprouty2 基因片段经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切回收,以BamHⅠ和SalⅠ双酶切LV-lacZ,获得慢病毒载体骨架LV,以EcoRⅠ和SalⅠ双酶切本实验保存的质粒LV-GFP 后以获得GFP 片段.然后用T4DNA 连接酶连接以上3 个片段,构建重组慢病毒质粒LV-Sprouty2-GFP,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确.经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人骨髓瘤细胞系RPMI8226,通过流式分选获得稳定转染细胞系的骨髓瘤细胞系,应用Real-timePCR、Western Blot 方法分别检测稳定转染细胞系的Sprouty2 mRNA 和Sprouty2 蛋白表达.CCK-8 法测定Sprouty2 对RPMI8226 细胞增殖能力的影响.软琼脂克隆形成试验检测细胞的克隆性生长能力.结果 限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带人Sprouty2 基因的重组慢病毒.包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达(1.2±0.25)×108 IU/ml.病毒感染RPMI8226 细胞后经流式细胞仪分选获得GFP+细胞,实时定量PCR 及WesternBlot 证实病毒感染后可有效上调Sprouty2 基因及蛋白的表达,证实稳定表达sprouty2 的骨髓瘤细胞株构建成功,命名为RPMI8226-S,对照细胞株为RPMI8226-G.CCK-8 方法检测显示与对照组相比RPMI8226-S 细胞体外增殖活性明显降低,与对照组相比有统计学差异(P＜0.05).软琼脂克隆形成试验表明病毒感染的RPMI8226 细胞的克隆性生长能力下降.结论 成功构建了表达Sprouty2 基因的慢病毒载体,获得可稳定上调Sprouty2 表达的RPMI8226 细胞株；并且细胞增殖实验和软琼脂克隆形成实验证实sprouty2 过表达后影响了骨髓瘤细胞的增殖和克隆形成能力,提示sprouty2 对骨髓瘤的发生、发展起到抑制作用.
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